Cinnamon essential oil as an antibacterial agent against Shewanella putrefaciens: Cell membrane disruption and metabolic dysfunction
肉桂精油作为对抗腐败希瓦氏菌的抗菌剂：细胞膜破坏与代谢功能障碍
来源：Food Bioscience 73 (2025) 107546
1. 摘要
本研究首次采用非靶向代谢组学技术探究了肉桂精油（CEO）对腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）的抗菌作用。结果表明，CEO能有效抑制腐败希瓦氏菌的生长，其最低抑菌浓度（MIC）为0.078 μL/mL。CEO可导致腐败希瓦氏菌出现显著的形态和超微结构畸变，并对其外膜和内膜造成严重损伤。经1×MIC浓度的CEO处理后，腐败希瓦氏菌的细胞膜通透性显著增加，碘化丙啶荧光强度较对照组升高5.10倍，1-N-苯基萘胺荧光强度升高0.39倍，同时伴随细胞膜去极化现象。这些变化导致核酸、蛋白质等关键生物大分子泄漏。此外，1×MIC浓度的CEO使腐败希瓦氏菌细胞内活性氧（ROS）积累，2,7-二氯荧光素二乙酸酯荧光强度较对照组升高85.71%，提示存在氧化损伤。非靶向代谢组学分析显示，1/2×MIC浓度的CEO改变了细菌的代谢谱，影响了多条代谢通路，主要包括氨基酸代谢、核苷酸代谢、谷胱甘肽代谢、叶酸介导的一碳代谢、泛酸与辅酶A生物合成以及甘油磷脂代谢。这些改变可能破坏核酸代谢、能量代谢和膜稳定性，同时细菌会激活核苷酸补救合成途径、维持氧化还原稳态并增强整体适应能力。本研究深化了对CEO抗菌作用机制的理解，凸显了其作为天然食品防腐剂的潜力。
2. 关键词
肉桂精油、腐败希瓦氏菌、抗菌作用、细胞膜破坏、非靶向代谢组学
3. 研究目的
系统探究肉桂精油对腐败希瓦氏菌的抗菌作用机制，通过生长曲线分析、电镜观察、细胞膜完整性检测、细胞内活性氧测定以及首次应用代谢组学和多元统计分析，深入阐明CEO的抑菌机理，为开发天然食品防腐剂提供新的视角和理论依据。
4. 研究思路
首先通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析肉桂精油的主要化学成分；采用微量肉汤稀释法测定CEO对腐败希瓦氏菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；利用芬兰Bioscreen C仪器绘制不同浓度CEO处理下细菌的生长曲线，评估其生长抑制效果；通过场发射扫描电镜（FE-SEM）和透射电镜（TEM）观察细菌形态和超微结构变化；检测细胞内核酸和蛋白质泄漏量、PI和NPN荧光强度、细胞膜电位变化，分析细胞膜完整性和通透性的改变；采用DCFH-DA探针测定细胞内ROS水平，评估氧化损伤程度；最后通过非靶向代谢组学技术分析1/2×MIC浓度CEO处理后细菌的代谢谱变化，结合KEGG数据库富集分析差异代谢物参与的代谢通路，从分子水平揭示CEO的抗菌机制。
5. 研究亮点
首次将非靶向代谢组学技术应用于肉桂精油对腐败希瓦氏菌抗菌机制的研究，从代谢调控层面揭示了多靶点抗菌作用；
系统整合了细胞形态学、细胞膜功能、氧化应激和代谢组学多维度数据，全面阐明了CEO通过细胞膜破坏与代谢功能障碍协同发挥抗菌作用的机制；
明确了腐败希瓦氏菌在亚致死浓度CEO胁迫下的适应性代谢应答，包括核苷酸补救合成、氧化还原稳态维持和膜修复等策略；
测定的CEO对腐败希瓦氏菌的MIC（0.078 μL/mL）远低于已有报道，证实了高反式肉桂醛含量（93.26%）的CEO具有更强的抗菌活性。
6. 可延伸的方向
在实际食品体系（如海鲜、禽肉、肉制品）中验证CEO的防腐效果，考察食品基质成分、pH值、储存条件及微生物竞争对其抗菌活性的影响；
探究CEO与其他天然防腐剂（如ε-聚赖氨酸、迷迭香精油）或食品加工技术（如高压处理、低温等离子体）的协同抗菌效应，降低使用浓度并提升实际应用价值；
进一步研究CEO中反式肉桂醛与其他次要成分的协同抗菌作用，明确各成分的贡献度；
结合转录组学和蛋白质组学技术，从基因和蛋白水平补充完善CEO的抗菌分子机制；
开发CEO的包埋递送体系（如纳米乳液、微胶囊），解决其挥发性强、水溶性差的问题，延长在食品中的作用时间。
7. 测量的数据及其研究意义
肉桂精油化学成分数据：通过GC-MS分析得到CEO的总离子扫描图（图1）和主要化学成分表（表1），结果显示反式肉桂醛为主要成分，占比93.26%。该数据明确了CEO发挥抗菌作用的核心活性物质，解释了其高抗菌活性的物质基础，同时为不同来源CEO抗菌活性差异提供了依据。
最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）数据：采用微量肉汤稀释法测定得到MIC为0.078 μL/mL，MBC为0.156 μL/mL。该数据量化了CEO对腐败希瓦氏菌的抗菌效力，为后续实验浓度设置和实际应用剂量提供了参考标准。
微生物生长曲线数据：使用Bioscreen C仪器测定不同浓度CEO处理下腐败希瓦氏菌的OD600值随时间的变化，绘制生长曲线（图2）。该数据直观展示了CEO对细菌生长的剂量依赖性抑制作用，验证了MIC和MBC测定结果的准确性，为后续细胞和分子水平实验的处理时间和浓度选择提供了依据。
细菌形态和超微结构数据：通过FE-SEM和TEM观察得到不同浓度CEO处理后细菌的显微图像（图3），包括细胞形态畸变、表面褶皱、内容物泄漏、细胞壁和细胞膜损伤、胞质空泡化等。该数据从直观形态学角度证实了CEO对细菌细胞结构的破坏作用，为细胞膜损伤机制提供了直接证据。
细胞内成分泄漏数据：测定不同浓度CEO处理后上清液中核酸和蛋白质的含量（图4）。该数据定量反映了细胞膜完整性的破坏程度，证明CEO导致细菌关键生物大分子泄漏，进而影响细胞正常生理功能。
细胞膜通透性数据：通过PI和NPN荧光探针测定得到内膜和外膜通透性变化数据（图5）。该数据分别定量了CEO对细菌内膜和外膜的损伤程度，明确了细胞膜是CEO抗菌作用的重要靶点。
细胞膜电位数据：使用DiBAC4(3)荧光探针测定得到细胞膜去极化数据（图6）。该数据表明CEO可导致细菌细胞膜电位丧失，进一步证实了细胞膜功能的严重受损，而膜电位异常会影响ATP合成、物质转运等关键生命活动。
细胞内活性氧水平数据：通过DCFH-DA探针测定得到ROS积累数据（图7）。该数据揭示了CEO可诱导细菌产生氧化应激，氧化损伤是其抗菌作用的重要机制之一，同时ROS积累会进一步加剧细胞膜损伤。
代谢组学多元统计与差异代谢物数据：通过LC-MS/MS分析得到PCA得分图、OPLS-DA得分图、置换检验图、差异代谢物火山图、差异代谢物分类比例图、前50个差异代谢物热图（图8）。该数据清晰展示了CEO处理后细菌代谢谱的显著变化，筛选出586个差异代谢物，为后续通路分析奠定了基础。
代谢通路富集与调控数据：通过KEGG数据库分析得到KEGG分类图、富集通路图（图9），以及氨基酸代谢通路图（图10）、嘌呤和嘧啶代谢通路图（图11）。该数据从分子水平揭示了CEO对细菌代谢网络的干扰，明确了受影响的关键代谢通路，阐明了代谢功能障碍在抗菌作用中的核心地位，同时发现了细菌的适应性代谢应答机制。
8. 结论
本研究首次通过非靶向代谢组学技术系统分析了肉桂精油对腐败希瓦氏菌的多靶点抗菌机制，为天然食品防腐剂的开发提供了重要理论基础。研究结果表明，CEO通过细胞水平和代谢调控水平的协同作用有效抑制腐败希瓦氏菌生长。在细胞水平，CEO诱导细菌形态和超微结构畸变，增加细胞膜通透性并导致膜去极化，引起核酸、蛋白质等生物大分子泄漏；同时触发细胞内ROS积累，造成氧化损伤。在代谢调控水平，CEO显著干扰多条关键代谢通路：降低核苷酸代谢中的核苷单磷酸（NMP）水平，阻碍核酸合成；减少泛酸与辅酶A生物合成途径中的泛酸含量，破坏能量代谢；下调甘油磷脂代谢中的磷脂酰胆碱（PC）含量，抑制叶酸介导的一碳代谢途径中的四氢叶酸再生，损害细胞膜磷脂稳态。这些破坏共同损伤了细菌的基本细胞功能，发挥抗菌效果。同时，腐败希瓦氏菌会通过上调核苷酸、氨基酸和谷胱甘肽含量等适应性策略，激活核苷酸补救合成途径、维持氧化还原稳态并增强整体适应能力以应对CEO胁迫。本研究不仅深化了对CEO抗腐败希瓦氏菌机制的科学认识，也揭示了其作为天然抗菌剂在食品保鲜中的应用潜力，为开发高效安全的食品保鲜方法提供了新的分子靶点和干预策略。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪在本研究中用于实时、连续监测腐败希瓦氏菌在不同浓度肉桂精油处理下的生长动态，其测量的OD600值随时间变化的生长曲线（图2）具有以下关键研究意义：
直观验证抗菌活性的剂量依赖性：生长曲线清晰显示，对照组细菌在14小时内快速生长，OD600峰值约为0.90；1/2×MIC浓度的CEO仅轻微延缓细菌生长，OD600仍呈上升趋势；1×MIC浓度的CEO使细菌OD600先小幅上升后趋于稳定甚至略有下降，完全抑制了细菌的对数生长期；2×MIC浓度的CEO则使OD600始终维持在极低水平，表现出明显的杀菌效果。这一结果直观证明了CEO对腐败希瓦氏菌的抑制作用具有显著的剂量依赖性，与后续MIC和MBC的测定结果（MIC=0.078 μL/mL，MBC=0.156 μL/mL）相互印证，确保了抗菌活性定量数据的可靠性。
为后续实验参数设置提供科学依据：生长曲线反映了细菌在不同CEO浓度下的生长状态和时间动力学特征。本研究选择处理4小时进行后续的细胞形态、细胞膜功能和代谢组学分析，正是基于生长曲线的结果：此时对照组细菌处于对数生长期中期，生理状态均一；而不同浓度CEO处理组已表现出明显的生长差异，能够准确反映CEO对细菌的早期作用机制。同时，1/2×MIC（亚致死浓度）和1×MIC（致死浓度）的选择也基于生长曲线的区分度，确保既能观察到细菌的损伤效应，又能检测到亚致死浓度下的适应性代谢应答。
建立抗菌作用的时间动力学基础：Bioscreen仪器每1小时自动测定一次OD600值，实现了对细菌生长的连续监测，避免了传统手动测定的误差和时间点缺失。通过生长曲线可以准确判断CEO的起效时间和作用持续时间，例如1×MIC浓度的CEO在处理约4小时后开始显著抑制细菌生长，这为理解细胞膜损伤、ROS积累等后续事件的时间顺序提供了基础，表明细胞膜通透性增加和内容物泄漏是导致细菌生长停滞的早期关键事件。
为实际食品保鲜应用提供参考：生长曲线数据量化了不同浓度CEO对腐败希瓦氏菌的抑制效率，可作为实际食品体系中CEO使用剂量的初步参考。例如，1×MIC浓度可在4小时内完全抑制细菌生长，而2×MIC浓度可实现快速杀菌，这为不同保质期要求的食品（如短期冷藏海鲜和长期冷冻肉制品）的防腐剂添加量设计提供了依据。同时，Bioscreen仪器的高通量特性（可同时测定100个样品）也为后续筛选CEO与其他防腐剂的协同组合提供了高效的实验平台。
关联细胞和分子水平的机制研究：生长曲线反映的是细菌整体的生长表型，而后续的细胞膜损伤、氧化应激和代谢组学数据则是解释这一表型的分子机制。通过将生长曲线的表型变化与分子水平的机制数据相结合，可以建立“抗菌表型-细胞损伤-代谢紊乱”的完整逻辑链。例如，1×MIC浓度下细菌生长停滞与细胞膜通透性显著增加、ROS大量积累以及核苷酸合成抑制等分子事件在时间上高度一致，证明这些机制共同导致了细菌生长的抑制。