Chemical composition, antioxidant potential, and antibacterial mechanism of Bischofia javanica ethanol extract against Staphylococcus aureus
秋枫乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的化学成分、抗氧化潜能及抗菌机制
来源：LWT - Food Science and Technology 222 (2025) 117682
1. 摘要
本研究系统探究了秋枫（Bischofia javanica Blume）乙醇提取物（BJBE）的化学成分、抗氧化特性及其对金黄色葡萄球菌的抗菌作用机制。通过超高效液相色谱-电喷雾电离质谱（UPLC-ESI-MS）分析，共鉴定出10种化合物，包括2种甾醇、6种黄酮醇和2种酚酸，其中β-谷甾醇、山奈酚和没食子酸为主要成分。ABTS和DPPH自由基清除实验表明，BJBE具有较强的抗氧化活性。其对金黄色葡萄球菌的生长抑制呈浓度依赖性，最低抑菌浓度（MIC）为2.60 mg/mL。抗菌机制研究发现，BJBE可通过降低胞内ATP水平、引起细胞膜去极化、诱导胞质内容物泄漏、减少细菌总蛋白含量、抑制生物膜形成以及损伤细胞壁和细胞膜等多种途径发挥杀菌作用。研究结果表明，BJBE具有作为天然食品防腐剂或杀菌剂的潜力，可有效解决食品加工和处理环境中由金黄色葡萄球菌引起的食品安全问题。
2. 关键词
秋枫提取物、化学成分、抗氧化潜能、金黄色葡萄球菌、抗菌活性、作用机制
3. 研究目的
针对秋枫提取物抗菌作用机制不明、化学成分信息有限的现状，系统分析其乙醇提取物的化学组成，评估其抗氧化活性，明确其对食品常见致病菌金黄色葡萄球菌的抗菌效力，并从细胞壁/细胞膜完整性、能量代谢、生物膜形成等多个层面阐明其抗菌分子机制，为开发安全、高效的天然食品防腐剂提供科学依据和理论基础。
4. 研究思路
首先采用80%乙醇超声提取法制备秋枫叶片提取物；通过两种不同的UPLC-MS系统对提取物的化学成分进行全面鉴定和定量分析；利用ABTS和DPPH自由基清除实验评估其体外抗氧化活性；采用微量肉汤稀释法测定其对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度；使用芬兰Bioscreen C PRO全自动生长曲线分析仪绘制不同浓度提取物处理下细菌的生长曲线，验证其生长抑制效果；通过检测胞外碱性磷酸酶（AKP）活性、胞内ATP含量、胞外蛋白泄漏量、细胞膜电位变化，结合激光共聚焦显微镜（CLSM）和场发射扫描电镜（FEGSEM）观察，从细胞结构和生理功能层面揭示其抗菌机制；最后通过结晶紫染色法评估其对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用。
5. 研究亮点
首次在秋枫乙醇提取物中鉴定出山奈酚、没食子酸、绿原酸、橙皮素和芦丁5种化合物，丰富了秋枫的化学成分数据库。
系统阐明了秋枫乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的多靶点抗菌机制，首次证实其通过同时损伤细胞壁和细胞膜、干扰能量代谢以及抑制生物膜形成发挥协同抗菌作用。
明确了秋枫提取物同时具有强抗氧化和抗菌双重活性，为其作为多功能天然食品添加剂的开发提供了全面的科学依据。
定量分析了提取物中各主要活性成分的含量，为后续活性成分的分离纯化和质量标准建立奠定了基础。
6. 可延伸的方向
分离纯化秋枫提取物中的单体活性成分，研究各成分单独及协同作用的抗菌效果，明确主要抗菌活性物质。
在实际食品体系（如乳制品、肉制品、水产品）中验证秋枫提取物的防腐效果，考察食品基质成分、pH值、储存温度等因素对其抗菌活性的影响。
开发微胶囊、纳米乳液等包埋递送体系，解决秋枫提取物挥发性强、水溶性差、易氧化等问题，提高其在食品中的稳定性和生物利用度。
结合转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术，从分子水平深入揭示秋枫提取物对金黄色葡萄球菌的全局调控机制。
开展动物体内实验和毒理学评价，评估秋枫提取物的食用安全性和长期毒性，为其产业化应用提供安全保障。
探究秋枫提取物与其他天然防腐剂（如肉桂精油、ε-聚赖氨酸）或食品加工技术（如低温、高压）的协同抗菌效应，降低使用剂量并提升防腐效果。
7. 测量的数据及其研究意义
化学成分定量数据：通过UPLC-ESI-MS鉴定得到10种化合物的精确含量，数据来自表1和表2。该数据明确了秋枫乙醇提取物的物质基础，揭示了β-谷甾醇（占总成分70%）、山奈酚（18%）和没食子酸（5%）为主要活性成分，为解释其抗氧化和抗菌活性提供了直接依据。
抗氧化活性数据：不同浓度提取物的ABTS和DPPH自由基清除率及对应的IC50值，数据来自图1。该数据量化了提取物的抗氧化能力，其中ABTS的IC50为85 μg/mL，DPPH的IC50为127 μg/mL，表明其具有良好的自由基清除能力，可作为天然抗氧化剂应用于食品工业。
最低抑菌浓度（MIC）数据：通过微量肉汤稀释法测定得到BJBE对金黄色葡萄球菌的MIC为2.60 mg/mL。该数据确定了提取物的有效抗菌浓度，为后续所有抗菌机制实验的浓度设置提供了标准参考。
细菌生长曲线数据：使用芬兰Bioscreen C PRO仪器测定0 MIC、0.25 MIC、0.5 MIC和1 MIC浓度下金黄色葡萄球菌的OD600随时间变化曲线，数据来自图2。该数据直观展示了提取物对细菌生长的剂量依赖性抑制作用，验证了MIC测定结果的准确性。
胞外AKP酶活性数据：不同时间点（0、3、6、9 h）不同浓度提取物处理后的胞外AKP酶活性，数据来自图3。AKP是位于细菌细胞壁和细胞膜之间的标志性酶，其胞外含量升高直接证明提取物能够破坏金黄色葡萄球菌的细胞壁完整性。
胞外蛋白含量数据：不同时间点（1-6 h）不同浓度提取物处理后的胞外蛋白浓度，数据来自图4。该数据定量反映了细菌细胞膜的损伤程度，表明提取物导致胞内蛋白质大量泄漏，进而影响细菌正常生理功能。
胞内ATP含量数据：不同浓度提取物处理30分钟后的胞内ATP水平，数据来自图5。ATP是细胞的主要能量物质，其含量显著下降表明提取物通过损伤细胞膜导致能量物质泄漏，同时可能抑制了细菌的能量代谢过程。
细胞膜电位数据：不同浓度提取物处理后的DiBAC4(3)荧光强度，数据来自图6。荧光强度升高表明提取物引起细菌细胞膜去极化，破坏了细胞膜的电化学梯度，进一步证实了细胞膜功能的严重受损。
生物膜形成能力数据：不同浓度提取物处理24小时后的生物膜生物量，数据来自图7。该数据表明BJBE能够显著抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，且抑制效果随浓度升高而增强，这对于控制食品加工设备表面的生物膜污染具有重要实际意义。
细胞活力数据：CLSM观察的活/死细胞荧光图像，数据来自图8。绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表死细胞，图像直观显示随着提取物浓度升高，死细胞比例显著增加，直接证实了提取物的杀菌效果。
细菌超微结构数据：FEGSEM观察的细菌形态变化图像，数据来自图9。该数据从形态学角度清晰展示了提取物对细菌的损伤作用，包括细胞皱缩、表面凹陷、穿孔以及胞质内容物泄漏，为细胞壁和细胞膜损伤机制提供了最直接的视觉证据。
8. 结论
本研究通过UPLC-MS技术全面分析了秋枫乙醇提取物的化学成分，共鉴定出10种化合物，其中β-谷甾醇为最主要成分，同时首次在秋枫中发现了山奈酚、没食子酸等5种活性物质。提取物表现出显著的抗氧化活性和对金黄色葡萄球菌的抗菌活性，其抗菌机制是多靶点协同作用的结果：首先破坏细菌细胞壁和细胞膜的完整性，导致AKP酶、蛋白质等胞内物质泄漏；同时引起细胞膜去极化，降低胞内ATP水平，干扰细菌能量代谢；此外还能有效抑制细菌生物膜的形成。作为一种传统可食用植物，秋枫具有良好的安全性和资源优势，其乙醇提取物在食品和制药工业中具有广阔的应用前景，可作为天然食品防腐剂和抗菌剂的潜在候选物。后续需进一步开展实际食品应用验证和安全性评价，推动其产业化发展。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
芬兰Bioscreen C PRO全自动生长曲线分析仪在本研究中用于实时、连续监测金黄色葡萄球菌在不同浓度秋枫乙醇提取物处理下的生长动态，其测量的OD600值随时间变化的生长曲线（图2）具有以下关键研究意义：
直观验证抗菌活性的剂量依赖性：生长曲线清晰呈现了不同浓度提取物对细菌生长的差异化影响。对照组（0 MIC）细菌在2小时延迟期后进入快速对数生长期，10小时后达到稳定期，OD600峰值约为1.8；0.25 MIC组细菌生长速率明显减慢，但仍能持续增殖；0.5 MIC组细菌生长被显著抑制，仅在4小时后有微弱增长；而1 MIC组的OD600值在整个24小时培养过程中基本保持在初始水平，完全没有出现增长趋势。这一结果直观且有力地证明了秋枫乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用具有严格的剂量依赖性，与之前通过微量肉汤稀释法测定的MIC值（2.60 mg/mL）完全吻合，相互验证了实验结果的准确性和可靠性。
明确区分抑菌与杀菌作用：生长曲线的形态特征能够准确区分抗菌物质的作用类型。0.25 MIC和0.5 MIC浓度下，细菌虽然生长受到抑制，但仍能缓慢增殖，表明低浓度提取物主要表现为抑菌作用，即抑制细菌繁殖但不直接杀死细菌；而1 MIC浓度下，细菌数量不仅没有增加，反而在培养后期略有下降，表明高浓度提取物具有杀菌作用，能够直接导致细菌死亡。这种区分对于实际食品防腐应用至关重要：对于短期储存的食品，可使用较低的抑菌浓度以减少添加剂用量；而对于需要长期储存或对微生物控制要求严格的食品，则必须使用杀菌浓度以确保食品安全。
揭示抗菌作用的时间动力学特征：Bioscreen仪器每2小时自动测定一次OD600值，实现了对细菌生长过程的无间断连续监测，避免了传统手动取样测定带来的操作误差和时间点缺失。通过生长曲线可以精确判断提取物的起效时间和作用持续时间：1 MIC浓度的提取物在处理2小时后即可完全抑制细菌生长，表明其具有快速杀菌效果；而0.5 MIC浓度则需要4小时才能表现出明显的抑制作用。这些时间动力学数据为实际食品加工中提取物的添加时机和作用周期提供了科学依据，有助于优化防腐工艺参数。
为后续机制研究的实验参数设置提供依据：生长曲线反映了细菌在不同生长阶段的生理状态，是设计后续机制实验的重要基础。本研究中选择处理4小时进行AKP酶活性、胞外蛋白含量、细胞膜电位等检测，正是基于生长曲线的结果：此时对照组细菌处于对数生长期中期，生理状态均一且代谢活跃；而不同浓度提取物处理组已表现出明显的生长差异，能够最准确地反映提取物对细菌的早期作用机制。如果采样时间过早，细菌损伤不明显；采样时间过晚，则可能因细菌死亡裂解导致结果失真。
建立表型与机制的关联逻辑：生长曲线反映的是细菌整体的生长表型，而后续的细胞壁损伤、细胞膜通透性改变、能量代谢紊乱等实验数据则是解释这一表型的分子机制。通过将生长曲线的表型变化与分子水平的机制数据相结合，可以建立完整的逻辑链条：1 MIC浓度下细菌生长停滞，对应着AKP酶和胞外蛋白的大量泄漏（细胞壁和细胞膜损伤）、胞内ATP的急剧下降（能量代谢衰竭）以及细胞膜去极化（膜功能丧失）。这些事件在时间上高度一致，共同证明了提取物通过破坏细胞结构和功能导致细菌死亡的核心机制。
为实际应用提供量化参考：生长曲线数据量化了不同浓度提取物对金黄色葡萄球菌生长的抑制效率，可作为实际食品体系中提取物使用剂量的初步参考。例如，1 MIC浓度可在24小时内完全抑制细菌生长，这对于保质期要求在24小时以内的即食食品具有直接的应用价值。同时，Bioscreen仪器的高通量特性（可同时测定100个样品）也为后续筛选秋枫提取物与其他防腐剂的协同组合、优化复配配方提供了高效的实验平台。