Inhibition mechanism of quorum sensing and biofilm formation of Pseudomonas fluorescens by a novel quorum quenching bacteria Lactiplantibacillus plantarum YP4-1-2
新型群体感应淬灭菌植物乳杆菌YP4-1-2抑制荧光假单胞菌群体感应和生物膜形成的机制
来源：X.R. Lü et al. / Food Science and Human Wellness 14 (2025) 9250294
1. 摘要
荧光假单胞菌是食品中广泛存在的嗜冷性腐败菌，其腐败特性和生物膜形成受N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）型群体感应（QS）系统调控。群体感应淬灭（QQ）被认为是控制腐败菌的有效策略，可避免传统抗菌剂带来的耐药性风险。本研究发现了一株分离自牙鲆肠道的新型QQ菌植物乳杆菌YP4-1-2，其粗细胞提取物（CCE）对荧光假单胞菌的AHLs具有强淬灭活性。当CCE蛋白浓度为57、86和114 μg/mL时，对N-辛酰基-L-高丝氨酸内酯（C8-HSL）的降解率分别达到25.90%、78.57%和100%。此外，CCE能显著减少荧光假单胞菌的生物膜形成、细菌运动性（游泳和群集）以及胞外蛋白酶和生物胺的释放。实时聚合酶链反应（PCR）结果显示，CCE下调了QS相关基因（rhlI、rhlR、aprX、algA、orm、flgA和ldcA）的表达。通过全基因组测序分析，鉴定出CCE中的活性物质为青霉素V酰基转移酶（PVA），命名为LpPVA。同源建模和分子对接分析表明，LpPVA对长链AHLs的结合效果优于短链AHLs。本研究表明，植物乳杆菌YP4-1-2有望成为针对食源性腐败菌的新型QS抑制剂和抗生物膜剂。
2. 关键词
群体感应、群体感应淬灭、荧光假单胞菌、植物乳杆菌YP4-1-2、青霉素V酰基转移酶
3. 研究目的
针对荧光假单胞菌通过AHL型QS系统调控生物膜形成和食品腐败的问题，筛选并鉴定具有高效QQ活性的益生菌；明确植物乳杆菌YP4-1-2中QQ活性物质的类型和细胞定位；系统分析其对荧光假单胞菌生物膜形成、运动性及QS调控腐败表型的抑制作用；从细胞和分子水平揭示其QQ及抗生物膜机制；通过全基因组测序和生物信息学分析鉴定活性QQ酶，并阐明其与不同链长AHLs的相互作用模式，为开发基于QQ的绿色食品防腐技术提供理论依据和菌株资源。
4. 研究思路
首先从牙鲆肠道中分离得到具有AHL降解活性的植物乳杆菌YP4-1-2；分别制备其无细胞上清液（CFS）和粗细胞提取物（CCE），通过紫色杆菌CV026生物传感器法确定QQ活性物质的定位和酶类型；采用Bradford法测定CCE蛋白浓度，利用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定CCE对荧光假单胞菌和紫色杆菌CV026的最低抑菌浓度（MIC），确保其在有效浓度下不抑制细菌生长；通过琼脂孔扩散法测定CCE对不同链长AHLs（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL）的降解活性，计算酶活力；采用结晶紫染色法、扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估CCE对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用及对成熟生物膜的清除能力；通过游泳和群集实验检测CCE对细菌运动性的影响；利用琼脂孔扩散法和生物胺筛选培养基测定CCE对胞外蛋白酶和生物胺释放的抑制作用；通过qRT-PCR分析CCE对荧光假单胞菌QS相关基因表达的影响；对植物乳杆菌YP4-1-2进行全基因组测序，结合功能注释鉴定潜在的QQ酶编码基因；通过系统发育分析、同源建模和分子对接技术，阐明QQ酶的结构特征及其与不同链长AHLs的相互作用机制。
5. 研究亮点
首次从牙鲆肠道中分离得到一株具有高效AHL降解活性的植物乳杆菌YP4-1-2，其CCE在114 μg/mL浓度下可完全降解C8-HSL，且在实验浓度范围内不抑制细菌生长，避免了传统抗菌剂带来的耐药性选择压力。
明确了QQ活性物质为胞内的青霉素V酰基转移酶（LpPVA），属于胆酰甘氨酸水解酶（CGH）家族，丰富了乳酸菌来源的QQ酶资源，为新型QQ剂的开发提供了新的靶点。
系统揭示了LpPVA的底物偏好性，其对长链AHLs的降解和结合能力显著优于短链AHLs，分子对接结果表明这与长链AHLs和酶活性位点之间更强的疏水相互作用和氢键作用有关。
证实了该菌株CCE不仅能显著抑制荧光假单胞菌生物膜的形成（抑制率达61.89%），还能有效清除成熟生物膜（清除率达46.67%），同时完全抑制胞外蛋白酶和生物胺等QS调控的腐败表型，具有全面的食品防腐潜力。
从基因水平阐明了其作用机制，CCE通过降解AHLs信号分子，下调QS系统核心基因rhlI/rhlR及下游生物膜、运动性、蛋白酶和生物胺合成相关基因的表达，从而阻断细菌的群体行为。
所用菌株为食品级益生菌，生物安全性高，符合绿色食品添加剂的发展趋势，具有广阔的产业化应用前景。
6. 可延伸的方向
优化LpPVA的异源表达和纯化工艺，提高酶的产量和稳定性，降低生产成本，为工业化应用奠定基础。
研究LpPVA在不同食品基质（如牛奶、肉类、水产品）中的稳定性和QQ活性，评估其在实际食品防腐中的应用效果和保质期延长能力。
开发基于植物乳杆菌YP4-1-2或LpPVA的复合防腐体系，与天然提取物、物理保鲜技术（如低温、气调包装、紫外线）结合，实现协同增效。
开展动物体内实验，验证该菌株的益生菌特性和生物安全性，评估其在肠道内的定植能力和对肠道菌群的影响。
通过定点突变技术改造LpPVA的活性位点，提高其对短链AHLs的降解活性，拓宽底物谱，增强其对不同腐败菌的广谱QQ效果。
研究该菌株在食品加工设备表面的生物膜形成能力及其对设备表面腐败菌生物膜的清除效果，为食品加工环境的清洁消毒提供新方法。
结合转录组学和蛋白质组学技术，全面解析CCE处理后荧光假单胞菌的全局基因和蛋白表达变化，进一步完善其作用机制。
开发基于LpPVA的智能食品包装材料，实现QS信号分子的实时降解和食品新鲜度的监测。
7. 测量的数据及其研究意义
QQ活性物质的定位和类型数据：包括CFS和CCE处理后紫色杆菌CV026的产紫情况，以及酸化处理后AHL活性的恢复情况，数据来自图1a。该数据明确了QQ活性物质存在于胞内（CCE），且酸化处理后AHL活性未恢复，说明其不属于内酯酶类，而是酰基转移酶类，为后续活性物质的鉴定提供了明确方向。
CCE对荧光假单胞菌和紫色杆菌CV026的生长曲线数据，数据来自图1b和1c。该数据证实了在14.25-228 μg/mL浓度范围内，CCE不抑制两种细菌的生长，说明其QQ作用是通过降解信号分子而非杀菌实现的，避免了耐药性风险，确定了后续实验的浓度范围（57、86、114 μg/mL）。
CCE对不同链长AHLs（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL）的降解率数据，数据来自图1d。该数据表明CCE对AHLs的降解具有浓度依赖性和链长偏好性，对长链C8-HSL的降解活性最高，114 μg/mL时降解率达100%，为其在食品中的应用提供了剂量参考。
CCE对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制率及浮游菌存活率数据，数据来自图2a和2b。该数据定量评估了CCE的抗生物膜活性，114 μg/mL时抑制率达61.89%，且不影响浮游菌存活，证实了其抗生物膜作用与QS淬灭相关而非杀菌作用。
CCE对成熟荧光假单胞菌生物膜的清除率及浮游菌存活率数据，数据来自图2e和2f。该数据表明CCE不仅能抑制生物膜形成，还能有效清除已形成的成熟生物膜，114 μg/mL时清除率达46.67%，解决了成熟生物膜难以去除的行业难题。
荧光假单胞菌生物膜的SEM和CLSM图像，数据来自图2c、2d、2g、2h。这些图像直观展示了CCE处理后生物膜结构的变化：生物膜厚度从35 μm降至11 μm，细胞排列变得稀疏，胞外基质显著减少，为抗生物膜作用提供了直接的形态学证据。
CCE对荧光假单胞菌游泳和群集运动性的抑制率数据，数据来自图3a-3d。该数据表明CCE能显著抑制细菌的运动性，114 μg/mL时游泳和群集抑制率分别达58.42%和89.77%，说明其通过抑制细菌运动来减少生物膜的初始附着。
CCE对荧光假单胞菌胞外蛋白酶和生物胺释放的抑制率数据，数据来自图3e和3f。该数据证实了CCE能有效抑制QS调控的腐败表型，114 μg/mL时对两者的抑制率均达100%，直接证明了其在食品防腐中的实际应用价值。
荧光假单胞菌QS相关基因（rhlI、rhlR、aprX、algA、orm、flgA、ldcA、HZ99-RS00670）的相对表达量数据，数据来自图4。该数据从分子水平揭示了CCE的作用机制，通过下调QS系统核心基因rhlI/rhlR及下游功能基因的表达，阻断细菌的群体行为和腐败特性。
LpPVA的系统发育树数据，数据来自图5a。该数据表明LpPVA属于Ntn水解酶超家族的CGH家族，与植物乳杆菌来源的胆酰甘氨酸水解酶具有100%的同源性，明确了其分类地位和进化关系。
LpPVA的三维结构模型及Ramachandran图评估数据，数据来自图5b和5c。该数据验证了构建的蛋白模型具有合理的构象，90.5%的氨基酸位于最适区域，为后续分子对接分析提供了可靠的结构基础。
LpPVA与不同链长AHLs（C4-HSL至C14-HSL）的分子对接能量及相互作用数据，数据来自表1。该数据从原子水平阐明了LpPVA的底物偏好性，对接能量随AHL碳链长度增加而降低，说明其对长链AHLs的结合能力更强，与降解实验结果高度一致。
8. 结论
本研究从牙鲆肠道中分离得到一株新型群体感应淬灭菌植物乳杆菌YP4-1-2，其胞内粗提物CCE对荧光假单胞菌的AHL信号分子具有高效降解活性，且在有效浓度下不抑制细菌生长，无耐药性选择压力。CCE能显著抑制荧光假单胞菌的生物膜形成（抑制率61.89%）和清除成熟生物膜（清除率46.67%），同时抑制细菌的运动性、胞外蛋白酶和生物胺的释放。qRT-PCR结果表明，CCE通过降解AHLs信号分子，下调QS系统核心基因rhlI/rhlR及下游生物膜、运动性、蛋白酶和生物胺合成相关基因的表达。通过全基因组测序鉴定出活性物质为青霉素V酰基转移酶LpPVA，同源建模和分子对接分析显示其对长链AHLs的结合能力优于短链AHLs。本研究证实了植物乳杆菌YP4-1-2及其产生的LpPVA作为新型绿色QS抑制剂和抗生物膜剂的巨大潜力，为控制荧光假单胞菌引起的食品腐败提供了安全、有效的新策略。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定了不同浓度CCE（14.25、28.5、57、114、228 μg/mL）处理下荧光假单胞菌和紫色杆菌CV026的24小时生长曲线，其测量数据具有以下关键研究意义：
核心区分QQ作用与杀菌作用：传统抗菌剂通过抑制或杀死细菌发挥作用，易诱导细菌产生耐药性；而QQ剂通过阻断细菌间的信号交流发挥作用，不影响细菌的正常生长，因此不会产生耐药性选择压力。Bioscreen的连续生长曲线数据清晰显示，在14.25-228 μg/mL浓度范围内，两种细菌均呈现与对照组一致的S型生长曲线，最大OD值和生长速率无显著差异，直接证实了CCE的作用是通过淬灭QS信号而非杀菌实现的，这是QQ剂区别于传统抗菌剂的核心特征，也是其作为绿色食品防腐剂的重要优势。
确定安全有效的实验浓度范围：生长曲线数据明确了CCE在228 μg/mL以下浓度均不抑制细菌生长，因此后续实验选择了57、86、114 μg/mL三个浓度梯度，确保在有效发挥QQ活性的同时，避免对细菌生长产生非特异性影响，保证了生物膜、运动性、基因表达等后续实验结果的可靠性，排除了“细菌生长受抑制导致表型变化”的干扰。
验证MIC值的准确性：通过每2小时自动监测OD值的变化，能够准确判断细菌是否被完全抑制。本研究中生长曲线结果与肉汤微量稀释法测定的MIC值完全一致，进一步证实了CCE在实验浓度下无抗菌活性，为其作为QQ剂的安全性提供了双重数据支持。
高通量自动化监测，提高实验效率和重复性：Bioscreen仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时测定多个样品的生长曲线，无需人工定时取样和测量，大大减少了实验误差和工作量。本研究中同时测定了6个浓度组和对照组的生长曲线，每个样品做3个生物学重复，在24小时内自动完成所有数据采集，显著提高了实验效率和数据的重复性。
标准化实验条件，保证数据可比性：仪器能够精确控制培养温度（30℃）和振荡条件，所有样品在完全相同的环境下培养，数据由仪器自动采集和记录，避免了人为操作带来的主观误差和批次间差异，使不同实验间的数据具有良好的可比性。
为后续机制研究提供基础支撑：生长曲线反映了细菌的整体生长状态，结合后续的生物膜、运动性和基因表达实验结果，可以更全面地阐明CCE的作用机制。例如，生长曲线显示细菌生长未受抑制，但生物膜形成和运动性显著降低，进一步证实了这些表型的变化是由QS系统被阻断引起的，而非细菌生长受到抑制的结果，为机制解释提供了关键依据。
为实际应用提供安全依据：CCE在有效浓度下不抑制细菌生长，说明其不会对食品中的有益菌产生负面影响，同时避免了耐药性的产生，为其在食品工业中的安全应用提供了重要的科学依据，也为后续的毒理学评价和食品添加剂申报奠定了基础。