Na/N doped carbon dot nanozymes with enhanced peroxidase activity for antimicrobial food preservation
具有增强过氧化物酶活性的Na/N掺杂碳点纳米酶用于抗菌食品保存
来源：Food Chemistry 491 (2025) 145191
1. 摘要
全球每年高达25%的食品因微生物污染发生腐败变质，传统抗菌纳米材料存在使用剂量高、催化活性不足、稳定性差等问题。本研究开发了一种钠/氮共掺杂碳点纳米酶（Na/N-CDs nanozymes），晶格结构的改变显著增强了其结构稳定性，其过氧化物酶模拟活性是已报道辣根过氧化物酶（HRP）的4.3倍，催化活性较前体物质提升32倍以上。该纳米酶通过催化过氧化氢（H₂O₂）生成活性氧（ROS）发挥强效抗菌作用，最低抑菌浓度（MIC）低至0.03 mg·mL⁻¹；相比之下，铁、铜掺杂的碳点无纳米酶活性，MIC仅为0.5 mg·mL⁻¹。抗菌和腐败实验结果表明，Na/N-CDs通过破坏细菌细胞膜、降解DNA、抑制关键酶活性发挥抗菌作用，可将三文鱼片的保质期延长3天，显示出在水产品保鲜领域的巨大应用潜力。
2. 关键词
纳米酶、碳点、过氧化物酶、抗菌、食品保鲜
3. 研究目的
针对传统化学防腐剂的健康风险和现有抗菌纳米材料的缺陷，开发一种安全、高效、稳定且无重金属污染的新型碳基纳米酶；阐明钠/氮共掺杂增强碳点过氧化物酶活性的分子机制，揭示其广谱抗菌和抗生物膜的作用机理；验证其在三文鱼等水产品保鲜中的实际应用效果，为食品工业提供新型绿色抗菌保鲜技术。
4. 研究思路
首先以氯化钠、维生素C和丙氨酰谷氨酰胺（Ala-Gln）为前驱体，通过一步水热法合成Na/N-CDs纳米酶，同时制备Fe-CDs和Cu-CDs作为对照；利用透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱（XPS）等技术系统表征纳米酶的形貌、结构、元素组成和表面官能团；通过3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色实验、酶动力学分析和第一性原理计算，研究其过氧化物酶活性及催化增强机制；采用平板计数法测定对多种水产腐败菌和致病菌的MIC值，利用芬兰Bioscreen C PRO全自动生长曲线分析仪绘制细菌生长曲线，评估抗菌活性；通过扫描电子显微镜（SEM）、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、ROS检测、酶活性测定和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）等方法，从细胞和分子水平阐明抗菌和抗生物膜机理；通过溶血实验和CCK-8细胞毒性实验评估生物安全性；最后通过三文鱼保鲜实验，从微生物指标、理化指标和感官品质等方面验证其实际应用价值。
5. 研究亮点
首次采用钠掺杂替代传统重金属掺杂制备碳点纳米酶，避免了重金属的生物安全风险，同时实现了过氧化物酶活性的显著提升（是HRP的4.3倍），为绿色纳米酶的设计提供了新思路。
从理论和实验两方面揭示了钠掺杂增强催化活性的分子机制：通过引入杂质能级降低H₂O₂分解的能垒（从2.343 eV降至0.983 eV），促进羟基自由基（·OH）的生成。
该纳米酶具有广谱抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌、蜂房哈夫尼亚菌等多种致病菌和腐败菌均有抑制作用，且能有效破坏成熟的细菌生物膜，生物膜抑制率达84.04%。
生物安全性优异，在120 μg·mL⁻¹浓度下对HepG2细胞存活率无显著影响，500 μg·mL⁻¹浓度下溶血率低于5%，符合食品接触材料的安全要求。
实际应用效果显著，与H₂O₂联合使用可将4℃冷藏三文鱼的保质期延长3天，有效抑制微生物繁殖和蛋白质氧化，保持产品的感官品质和营养价值。
6. 可延伸的方向
优化纳米酶的合成工艺，通过调控掺杂比例、表面修饰等手段进一步提高其催化活性和靶向性，降低生产成本。
研究该纳米酶对其他食品基质（如肉类、乳制品、果蔬）中腐败菌和致病菌的抗菌效果，扩大其应用范围。
开发基于该纳米酶的复合保鲜体系，与气调包装、低温等离子体、天然提取物等技术结合，实现协同增效。
深入研究纳米酶在食品加工、储存过程中的迁移转化规律，建立相应的检测方法，评估其长期食用安全性。
探索该纳米酶在生物医学领域的应用，如伤口感染治疗、生物膜相关疾病的干预等。
开发基于该纳米酶的智能食品包装材料，实现抗菌保鲜与食品质量实时监测的一体化。
7. 测量的数据及其研究意义
Na/N-CDs的结构表征数据：包括TEM形貌图、粒径分布、XRD图谱、FTIR光谱、UV-Vis吸收光谱、荧光光谱、XPS全谱及C1s、O1s、Na1s分峰谱、zeta电位，数据来自图1。这些数据证实了Na/N-CDs的成功合成，明确了其球形形貌（平均粒径2.74±1.49 nm）、无定形晶体结构、表面亲水性官能团和元素组成（C 71.82%、O 25.54%、N 1.81%、Na 0.83%），为后续性能研究提供了结构基础。
过氧化物酶活性数据：包括TMB氧化产物的吸收光谱、TA氧化生成2-羟基对苯二甲酸的荧光光谱、DMPO捕获·OH的EPR信号、酶动力学双倒数图、不同pH/温度/离子强度下的活性稳定性，数据来自图2。这些数据证明了Na/N-CDs具有优异的过氧化物酶活性，明确了其米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax），确定了最适反应条件（pH 4、温度50℃），为抗菌应用提供了理论依据。
催化机制的理论计算数据：包括N-CDs和Na/N-CDs表面H₂O₂分解的自由能图、态密度（DOS）图、p带中心计算结果，数据来自图3。这些数据从原子水平揭示了钠掺杂增强催化活性的本质：通过Na s轨道与C p轨道的杂化引入杂质能级，提高C原子的p带中心，增强对H₂O₂的吸附能力，降低反应能垒。
体外抗菌活性数据：包括不同菌株的平板菌落照片、各菌株的MIC值、蜂房哈夫尼亚菌的生长曲线，数据来自图4。这些数据定量评估了Na/N-CDs的广谱抗菌活性，证明了其与H₂O₂的协同抗菌作用（FIC指数0.562），明确了有效作用浓度。
抗菌机理数据：包括蜂房哈夫尼亚菌的SEM和CLSM图像、细胞内ROS水平、Na⁺/K⁺-ATP酶活性、脱氢酶活性、总蛋白含量，数据来自图5和图6。这些数据阐明了Na/N-CDs的多靶点抗菌机理：通过产生·OH破坏细菌细胞膜完整性，抑制能量代谢关键酶活性，导致细胞内容物泄漏和蛋白质合成受阻。
生物安全性数据：包括HepG2细胞的CCK-8实验结果、大鼠红细胞的溶血实验结果，数据来自图6。这些数据证明了Na/N-CDs具有良好的生物相容性和血液相容性，为其在食品中的安全应用提供了保障。
抗生物膜活性数据：包括蜂房哈夫尼亚菌生物膜的SEM和CLSM 3D图像、生物膜生物量、抑制率、生长曲线、生物膜相关基因（fliC、motA、halR、halI）的RT-qPCR结果，数据来自图7。这些数据证明了Na/N-CDs不仅能抑制生物膜形成，还能破坏成熟生物膜，其机制与下调细菌运动性和群体感应相关基因的表达有关。
三文鱼保鲜效果数据：包括三文鱼的外观变化、肌肉组织切片、总菌落数（TVC）、总挥发性盐基氮（TVB-N）、持水性（WHC）、巯基含量、羰基含量、表面疏水性，数据来自图8。这些数据从微生物、理化和感官多个维度验证了Na/N-CDs在实际食品保鲜中的应用效果，证明其能有效延缓三文鱼的腐败变质。
8. 结论
本研究以氯化钠、维生素C和丙氨酰谷氨酰胺为原料，通过简单的水热法成功合成了具有优异过氧化物酶活性的Na/N-CDs纳米酶。钠掺杂通过调控电子结构显著降低了H₂O₂分解的能垒，使纳米酶的催化活性达到HRP的4.3倍。该纳米酶通过催化H₂O₂产生大量羟基自由基，从破坏细胞膜、抑制能量代谢、降低蛋白含量等多个层面发挥广谱抗菌作用，对多种水产致病菌和腐败菌的MIC低至0.03 mg·mL⁻¹，同时能有效抑制和破坏细菌生物膜。生物安全性实验表明，Na/N-CDs在高浓度下无明显细胞毒性和溶血作用。三文鱼保鲜实验证实，Na/N-CDs与H₂O₂联合使用可将4℃冷藏三文鱼的保质期延长3天，有效保持其品质。本研究开发的绿色纳米酶为食品抗菌保鲜提供了一种安全、高效的新技术，具有广阔的产业化应用前景。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰BIOSCREEN C PRO全自动生长曲线分析仪测定了蜂房哈夫尼亚菌在不同处理条件下的48小时生长曲线，其测量数据具有以下关键研究意义：
连续动态监测细菌生长全过程：Bioscreen仪器每30分钟自动记录一次OD₆₀₀值，无需人工取样，能够完整捕捉细菌从延迟期、对数生长期到稳定期的整个生长动力学过程。相比传统的平板计数法，避免了时间点缺失和操作误差，能够更准确地反映Na/N-CDs对细菌生长的动态影响，例如观察到单独使用Na/N-CDs只能暂时抑制细菌生长，而与H₂O₂联合使用能完全抑制细菌生长。
定量评估抗菌效果的时效关系：通过生长曲线可以精确计算不同处理组的延迟期长度、最大生长速率和达到特定OD值的时间，从而定量比较不同浓度Na/N-CDs以及与H₂O₂联合使用的抗菌效果。例如，数据显示在MIC浓度下，Na/N-CDs+H₂O₂组的细菌在48小时内几乎无生长，而单独Na/N-CDs组在培养20小时后细菌开始恢复生长，明确了协同作用的必要性。
验证MIC值的准确性：平板计数法测定的MIC值是终点结果，而生长曲线可以动态观察在MIC浓度下细菌的生长情况，验证MIC值是否能够完全抑制细菌生长。本研究中生长曲线结果与平板计数法测定的MIC值一致，进一步证实了Na/N-CDs的抗菌活性。
高通量筛选最优抗菌条件：Bioscreen仪器采用96孔板设计，可同时测定多个样品的生长曲线。本研究中同时测定了对照组、H₂O₂组、1/2 MIC Na/N-CDs组、1/2 MIC Na/N-CDs+H₂O₂组和MIC Na/N-CDs+H₂O₂组共5组样品的生长曲线，大大提高了实验效率，为快速筛选最优抗菌组合和浓度提供了技术支持。
标准化实验条件，提高数据重复性：Bioscreen仪器能够精确控制培养温度（28℃）和振荡条件，所有样品在完全相同的环境下培养，数据由仪器自动采集和导出，避免了人为操作带来的主观误差和批次间差异，提高了实验结果的重复性和可比性。
为抗菌机理研究提供基础：生长曲线反映了细菌的整体生长状态，结合后续的细胞膜完整性、酶活性、基因表达等实验结果，可以更全面地阐明Na/N-CDs的抗菌机理。例如，生长曲线显示细菌在处理后首先进入生长停滞期，随后细胞膜完整性被破坏，酶活性下降，这与ROS介导的氧化损伤机理一致。
为实际应用提供剂量参考：通过不同浓度Na/N-CDs的生长曲线，可以确定在食品保鲜中所需的最低有效剂量，避免过度使用带来的成本增加和安全风险，为产业化应用提供科学依据。