Modelling the Combined Effects of Oxalic Acid, Water Activity, and pH on the Growth and Mycotoxin Production of Aspergillus spp. in a Dried Fig System
草酸、水活性和pH值对干无花果系统中曲霉属生长及霉菌毒素生成的综合影响建模
来源：Foods 2025, 14, 3854.
1. 摘要
本研究旨在模拟田间温度条件下，探究水活性（(a_w)）、pH值和植物诱导子草酸（OA）对威氏曲霉（*Aspergillus welwitschiae*）和黄曲霉（*Aspergillus flavus*）在无花果基质上的生长及霉菌毒素生成的综合影响。采用响应面法（RSM）结合Box-Behnken设计（BBD），评估了(a_w)（0.92-0.99）、pH（5.6-6.3）和OA（1-2 mM）三个因素在模拟地中海地区田间昼夜温度循环下的作用效果，通过高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）定量检测赭曲霉毒素A（OTA）和黄曲霉毒素（AFs）。结果表明，(a_w)是调控真菌生长和产毒的最关键因素：最低(a_w)（0.92）显著延迟真菌生长并完全抑制OTA和黄曲霉毒素B₁（(AFB_1)）的产生，而高(a_w)（0.99）是霉菌毒素大量积累的必要条件。虽然测试浓度范围内的OA未表现出独立的霉菌毒素抑制作用，但其与(a_w)和pH的交互作用能显著延迟真菌生长。真菌生长模型的决定系数(R^2>96%)，拟合度良好；霉菌毒素模型的(R^2)值中等，反映了次级代谢的复杂性，但内部验证显示所有模型均可作为识别高风险条件的半定量工具（OTA模型验证相关系数(R>0.945)）。
2. 关键词
建模、半定量预测工具、霉菌毒素、真菌生长、诱导子
3. 研究目的
针对干无花果传统加工过程中易受曲霉污染、霉菌毒素超标严重的食品安全问题，系统研究草酸（作为潜在天然防控剂）、水活性和pH三个关键环境因素对威氏曲霉和黄曲霉生长及产毒的单独及交互作用；利用响应面法建立并验证能够预测这两种产毒真菌在无花果基质中生长动力学和霉菌毒素生成量的数学模型，为干无花果产业提供科学的风险评估工具和精准的防控策略依据。
4. 研究思路
首先制备基于新鲜无花果汁的半固体无花果培养基（SSFB），模拟干无花果的营养和理化特性；采用三因素三水平的Box-Behnken实验设计，设置15组不同的\(a_w\)、pH和OA组合条件；使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪，在模拟西班牙阿尔莫哈林地区无花果收获期昼夜温度循环的条件下，连续10天监测真菌生长的OD₆₀₀值；基于原始OD数据计算延迟期、最大生长速率（\(\mu_{max}\)）和不同OD值对应的检测时间（TTD）等生长动力学参数；培养结束后，采用HPLC-FLD法定量检测培养基中OTA、\(AFB_1\)和\(AFB_2\)的含量；通过方差分析（ANOVA）评估各因素及其交互作用对生长和产毒的影响显著性，建立二次多项式预测模型；最后使用5组独立的验证实验数据对模型的预测准确性进行评估。
5. 研究亮点
首次在无花果特异性基质中系统解析了草酸、水活性和pH对威氏曲霉和黄曲霉生长及产毒的交互调控机制，填补了干无花果霉菌防控领域的研究空白。
采用模拟地中海地区田间实际昼夜温度波动的培养条件，而非传统恒温培养，使实验结果更贴近干无花果自然干燥过程的真实场景，提升了模型的实用价值。
建立了高准确性的真菌生长预测模型（\(R^2>96\%\)）和具有实用价值的霉菌毒素半定量预测模型，为干无花果生产过程中的霉菌风险预警提供了量化工具。
明确了水活性是控制曲霉生长和产毒的决定性阈值因素，证实将\(a_w\)控制在0.92及以下可完全阻断OTA和\(AFB_1\)的产生，为干无花果干燥工艺的优化提供了明确的技术指标。
揭示了草酸作为植物诱导子在霉菌防控中的双重作用：虽无独立抑毒效果，但与低水活性和低pH协同作用可显著延迟真菌生长，为多屏障防控策略提供了新思路。
6. 可延伸的方向
在实际干无花果样品中验证模型的适用性，评估不同品种、产地、成熟度和加工方式（如日晒、烘干、冻干）对模型参数的影响，优化模型的普适性。
探究草酸与其他天然抑菌剂（如肉桂精油、丁香酚、ε-聚赖氨酸）或物理防控技术（如紫外线照射、低温等离子体、气调包装）的协同抑菌和抑毒效果，开发高效、安全的复合防控技术。
结合转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术，从分子水平揭示水活性和草酸调控曲霉生长及霉菌毒素生物合成的分子机制。
扩大研究范围，纳入更多与干无花果相关的产毒真菌（如赭曲霉、扩展青霉）和霉菌毒素（如伏马菌素、展青霉素），建立更全面的风险预测模型。
开发基于这些模型的手机应用或在线决策支持系统，方便干无花果生产者和监管人员进行实时风险评估和防控措施调整。
研究不同浓度草酸在无花果采前喷施和采后处理中的实际应用效果，优化施用剂量和时机，评估其对无花果品质和安全性的影响。
7. 测量的数据及其研究意义
真菌生长曲线数据：两种曲霉在15种不同条件下连续10天的OD₆₀₀随时间变化曲线，数据来自图1。该数据直观展示了不同环境条件对真菌生长的影响，明确了\(a_w\)的主导作用：0.92 \(a_w\)下两种曲霉几乎无生长，0.99 \(a_w\)下生长最快，同时也反映了黄曲霉对环境胁迫的敏感性高于威氏曲霉。
生长动力学参数的方差分析结果：延迟期和\(\mu_{max}\)的ANOVA p值、模型\(R^2\)及最优条件，数据来自表3。该数据量化了各因素对真菌生长的影响程度，证实\(a_w\)的线性和二次效应均极显著（\(p<0.001\)），而OA和pH的主效应不显著，但OA与pH的交互作用对威氏曲霉的\(\mu_{max}\)有显著影响（\(p=0.001\)）。
威氏曲霉不同OD值TTD的方差分析结果：OD₆₀₀为0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2时TTD的ANOVA p值、模型\(R^2\)及最优条件，数据来自表4。该数据进一步验证了\(a_w\)对生长的决定性作用，同时发现OA对低OD值（0.25）的TTD有显著影响（\(p=0.025\)），且OA与pH的交互作用对高OD值（1-2）的TTD有显著影响。
黄曲霉不同OD值TTD的方差分析结果：OD₆₀₀为0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2时TTD的ANOVA p值、模型\(R^2\)及最优条件，数据来自表5。该数据显示\(a_w\)对黄曲霉所有OD值的TTD均有极显著影响（\(p<0.001\)），OA的二次效应对低OD值（0.25-0.75）的TTD有显著影响，且\(a_w\)与OA的交互作用对延迟期有显著影响（\(p=0.037\)）。
霉菌毒素生成量的方差分析结果：OTA、\(AFB_1\)和\(AFB_2\)的ANOVA p值、模型\(R^2\)、失拟检验p值及最优条件，数据来自表6。该数据明确了只有\(a_w\)对三种霉菌毒素的生成有显著影响（\(p<0.05\)），OA和pH的主效应及交互作用均不显著，同时证实0.92 \(a_w\)下OTA和\(AFB_1\)的生成量为0。
生长和产毒的预测方程：仅包含显著因素的二次多项式预测模型及对应的\(R^2\)值，数据来自表7。该数据提供了具体的数学公式，可用于预测不同\(a_w\)、pH和OA组合下的真菌生长参数和霉菌毒素生成量，是风险评估的核心工具。
模型验证数据：5组独立验证实验的实测值与模型预测值的比较及相关系数R，数据来自表S4、表S5和表S6。该数据证实了生长模型的高预测准确性（威氏曲霉和黄曲霉的TTD和延迟期R>0.945），以及毒素模型作为半定量风险识别工具的可靠性（OTA模型R>0.945）。
8. 结论
本研究表明，水活性是控制干无花果系统中威氏曲霉和黄曲霉生长及产毒的最关键因素。将水活性维持在0.92及以下是预防这两种真菌增殖及其主要霉菌毒素（OTA和\(AFB_1\)）污染的最有效策略。草酸在1-2 mM的测试浓度范围内虽不能独立抑制霉菌毒素的产生，但与低水活性和低pH协同作用可显著延迟真菌生长，因此可作为干无花果多屏障防控体系的组成部分。本研究建立的真菌生长预测模型具有极高的准确性（\(R^2>96\%\)），霉菌毒素模型虽因次级代谢的复杂性表现出中等的拟合度，但内部验证结果显示其能够有效识别高风险条件。这些模型可作为半定量决策支持工具，帮助干无花果产业优化加工工艺、评估食品安全风险，从而生产出更安全的产品。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪在本研究中用于高通量、实时监测威氏曲霉和黄曲霉在15种不同环境条件下的生长动态，其测量的OD₆₀₀值随时间变化的生长曲线及衍生的生长动力学参数具有以下关键研究意义：
提供连续、高精度的生长动力学数据：Bioscreen仪器每30分钟自动记录一次OD₆₀₀值，连续监测10天，能够完整捕捉真菌从孢子萌发、延迟期、对数生长期到稳定期的整个生长过程。与传统的平板计数法相比，这种连续监测方式避免了手动取样带来的误差和时间点缺失，能够更精确地计算延迟期、最大生长速率和不同生物量对应的检测时间等动力学参数，为后续的响应面建模提供了高质量的基础数据。
实现高通量实验，提高研究效率：Bioscreen仪器采用100孔蜂窝板设计，可同时培养和监测100个样品。本研究中每个实验条件设置了10个技术重复，同时进行两种真菌的实验，共需要300个培养孔，Bioscreen的高通量特性使得如此大规模的实验能够在同一批次完成，大大减少了实验批次间的差异，提高了数据的可比性和实验效率。
模拟真实的温度波动环境：Bioscreen仪器支持可编程的温度控制，本研究中设置了模拟地中海地区无花果收获期昼夜温度变化的循环程序（20℃-31.4℃-20℃），而非传统的恒温培养。这种接近自然环境的培养条件使得真菌的生长行为更贴近干无花果实际干燥过程中的情况，从而提高了所建立模型的实用性和外推性。
量化环境因素对真菌生长的影响：基于Bioscreen测量的生长曲线数据，通过Baranyi模型拟合得到的延迟期、\(\mu_{max}\)和TTD等参数，能够定量反映不同\(a_w\)、pH和OA组合对真菌生长的影响程度。例如，数据显示0.92 \(a_w\)下威氏曲霉的延迟期延长至129.4小时，黄曲霉延长至178.2小时，而0.99 \(a_w\)下延迟期仅为40小时和16小时，这种量化的结果为明确各因素的作用权重提供了直接依据。
为响应面建模提供核心数据支撑：响应面法需要大量的实验数据来建立准确的预测模型，Bioscreen仪器提供的15种条件下的生长曲线数据，以及由此衍生的8个不同OD值的TTD数据，构成了本研究中生长模型的核心数据集。通过对这些数据进行ANOVA分析，能够识别出各因素的主效应、二次效应和交互作用，从而建立起能够预测不同条件下真菌生长的数学模型。
标准化实验方法，确保结果可重复性：Bioscreen仪器采用标准化的培养体系和数据采集流程，所有样品在相同的温度、振荡和检测条件下培养，数据由仪器自动记录和导出，避免了人为操作带来的主观误差。这种标准化的方法使得不同实验室之间的研究结果具有可比性，也为后续的模型验证和推广应用奠定了基础。
区分不同菌株的生长特性：通过对比Bioscreen测量的两种曲霉的生长曲线和参数，发现黄曲霉对低水活性的敏感性显著高于威氏曲霉，在相同的胁迫条件下黄曲霉的延迟期更长、生长速率更慢。这种菌株间的差异为制定针对性的霉菌防控策略提供了重要依据，例如对于黄曲霉污染风险较高的地区，可以适当降低干无花果的最终水活性阈值。