ARTP mutagenesis for genome-wide identification of genes important for biofilm regulation in spoilage bacterium Pseudomonas fluorescens PF08
ARTP诱变用于全基因组识别腐败细菌荧光假单胞菌PF08中对生物膜调控重要的基因
来源：June 2025 Volume 91 Issue 6 10.1128/aem.00218-25
1. 摘要
荧光假单胞菌是重要的食品腐败菌，常以生物膜形式导致食品变质，但其生物膜调控策略尚未完全阐明。本研究采用常压室温等离子体（ARTP）诱变结合全基因组重测序技术，对生物膜调控相关基因进行全基因组筛选。发现三个编码GGDEF-EAL结构域蛋白的基因（D7M10_RS02105、D7M10_RS27690和D7M10_RS25705）在生物膜细胞和游离细胞中表现出不同的突变特征。直接验证表明，D7M10_RS02105尤其是D7M10_RS27690的缺失突变体胞内环二鸟苷酸（c-di-GMP）水平显著升高。进一步研究发现，D7M10_RS27690缺失突变体中c-di-GMP水平升高会促进细胞生长、铁载体和胞外多糖的产生以及细胞自聚集，同时抑制细胞运动性，这些共同促进了生物膜的形成。RNA测序分析揭示了D7M10_RS27690调控的转录谱，主要包括鞭毛组装和肽聚糖生物合成通路，其中鞭毛组装通路的下调基因通过qRT-PCR验证，与细胞运动性降低的结果一致。
2. 关键词
常压室温等离子体诱变、荧光假单胞菌、生物膜、环二鸟苷酸、铁载体
3. 研究目的
针对食品腐败菌荧光假单胞菌PF08生物膜调控机制不明的问题，建立一种高效的全基因组筛选方法，识别参与其生物膜调控的关键基因，阐明c-di-GMP信号通路在生物膜形成中的作用机制，为开发食品生物膜防控策略提供理论依据和新靶点。
4. 研究思路
首先利用ARTP诱变技术构建荧光假单胞菌PF08的突变体文库；将突变体文库进行生物膜培养后，分别收集游离细胞和生物膜细胞并提取基因组DNA；通过全基因组重测序分析两种细胞群体的基因突变差异，筛选出潜在的生物膜调控基因；重点关注编码GGDEF-EAL结构域蛋白的基因，构建其缺失突变体；测定突变体的胞内c-di-GMP水平、生长曲线、生物膜形成能力、铁载体和胞外多糖产量、细胞运动性、自聚集能力和疏水性等表型；通过RNA测序和qRT-PCR分析关键基因调控的转录组变化，结合KEGG通路富集分析阐明其调控生物膜形成的分子机制。
5. 研究亮点
首次将ARTP诱变与全基因组重测序技术结合，建立了一种高效、高通量的细菌生物膜调控基因全基因组筛选方法，克服了传统转座子诱变繁琐耗时的缺点。
在食品腐败菌荧光假单胞菌PF08中首次鉴定出两个具有磷酸二酯酶（PDE）活性的GGDEF-EAL结构域蛋白（D7M10_RS02105和D7M10_RS27690），明确了其通过降解c-di-GMP负调控生物膜形成的功能。
系统阐明了c-di-GMP在荧光假单胞菌PF08中调控生物膜形成的多效性机制，包括促进铁载体和胞外多糖产生、抑制鞭毛依赖的细胞运动性以及增强细胞自聚集。
发现c-di-GMP与铁载体合成之间的正调控关系，为理解细菌生物膜形成与铁代谢的关联提供了新视角。
6. 可延伸的方向
进一步研究筛选出的其他潜在生物膜调控基因（如双组分系统、群体感应相关基因）的功能，完善荧光假单胞菌PF08的生物膜调控网络。
探究D7M10_RS25705作为c-di-GMP受体蛋白调控细胞运动性和铁载体产生的具体分子机制。
在实际食品体系（如乳制品、水产品）中验证靶向c-di-GMP通路的生物膜防控策略的有效性。
开发基于ARTP诱变的高通量筛选平台，用于识别其他食品腐败菌和致病菌的生物膜调控基因。
研究c-di-GMP与群体感应系统在荧光假单胞菌生物膜形成中的协同调控机制。
7. 测量的数据及其研究意义
全基因组突变谱数据：通过全基因组重测序得到生物膜细胞和游离细胞的突变图谱（图1B）和不同类型突变基因统计数据（图1C）。该数据证明ARTP诱变构建的突变体文库具有高度多样性和全基因组覆盖度，生物膜细胞和游离细胞的突变谱差异为筛选生物膜调控基因提供了基础。
目标基因测序深度数据：三个候选GGDEF-EAL结构域蛋白编码基因在游离细胞和生物膜细胞中的测序深度谱（图2A）。该数据直观显示了三个基因在两种细胞群体中的突变频率差异，为预测其作为生物膜负调控因子提供了基因组学证据。
微生物生长曲线数据：使用芬兰Bioscreen C仪器测定野生型（WT）和三个缺失突变体（ΔDR105、ΔDR690、ΔDR705）的OD600随时间变化的生长曲线（图2B）。该数据反映了基因缺失对细菌生长的影响，为后续c-di-GMP和生物膜定量数据的标准化提供了生长背景校正依据。
胞内c-di-GMP水平数据：通过ELISA试剂盒测定WT和突变体的胞内c-di-GMP含量（图2C）。该数据直接证明了D7M10_RS02105和D7M10_RS27690具有PDE活性，能够降解c-di-GMP，而D7M10_RS25705不参与c-di-GMP的代谢。
生物膜生物量数据：采用结晶紫法测定不同培养时间（12h、24h）WT和突变体的生物膜生物量（图3A）。该数据量化了基因缺失对生物膜形成能力的影响，验证了D7M10_RS02105和D7M10_RS27690作为生物膜负调控因子的功能。
生物膜形态数据：通过扫描电镜（SEM）观察WT和ΔDR690的生物膜微观结构（图3B）。该数据从形态学角度直观展示了ΔDR690突变体生物膜更致密、胞外基质更丰富的特征，为生物膜生物量的定量结果提供了直观证据。
铁载体相对产量数据：采用铬天青S（CAS）法测定WT和突变体的铁载体相对产量（图4A）。该数据揭示了c-di-GMP水平与铁载体合成之间的正相关关系，为理解铁代谢在生物膜形成中的作用提供了依据。
胞外多糖产量数据：通过刚果红染色观察WT和突变体的菌落形态（图4B）。该数据半定量地反映了胞外多糖的产量变化，证明c-di-GMP水平升高会促进胞外多糖的合成。
细胞运动性数据：通过半固体琼脂平板测定WT和突变体的游泳运动圈直径（图4C）。该数据表明c-di-GMP水平升高会显著抑制细菌的鞭毛依赖运动性，这是其促进生物膜形成的重要机制之一。
细胞自聚集数据：通过静置培养后测定上清液OD600的变化，计算WT和突变体的自聚集率（图4D）。该数据证明c-di-GMP水平升高会增强细胞的自聚集能力，有利于生物膜的初始形成。
细胞疏水性数据：通过乙酸乙酯两相分配法测定WT和突变体的细胞表面疏水性（图4E）。该数据表明三个基因的缺失对细胞表面疏水性无显著影响，排除了疏水性变化对生物膜形成的影响。
转录组差异表达数据：通过RNA测序得到ΔDR690与WT的差异表达基因火山图（图5A）和KEGG通路富集散点图（图5B）。该数据从全转录组水平揭示了D7M10_RS27690调控的基因和通路，为阐明其分子机制提供了全局视角。
鞭毛组装通路基因表达数据：展示了差异表达基因在鞭毛组装通路中的位置（图6A），并通过qRT-PCR验证了关键基因的转录水平（图6B）。该数据在分子水平验证了c-di-GMP通过抑制鞭毛组装相关基因的表达来降低细胞运动性的机制。
蛋白结构域预测数据：通过SMART数据库预测三个候选蛋白的结构域组成（表1）。该数据为预测其c-di-GMP代谢酶活性提供了生物信息学依据。
8. 结论
本研究建立了一种基于ARTP诱变结合全基因组重测序的高效高通量方法，用于筛选食品腐败菌荧光假单胞菌PF08的生物膜调控基因。通过该方法筛选出三个编码GGDEF-EAL结构域蛋白的候选基因，其中D7M10_RS02105和D7M10_RS27690具有磷酸二酯酶活性，能够降解胞内c-di-GMP，负调控生物膜形成。D7M10_RS27690缺失导致的c-di-GMP水平升高通过多种途径促进生物膜形成：促进细胞生长、铁载体和胞外多糖的产生，增强细胞自聚集能力，同时通过下调鞭毛组装相关基因的表达抑制细胞运动性。此外，转录组分析还发现c-di-GMP可能通过调控肽聚糖生物合成通路影响生物膜结构。本研究不仅阐明了c-di-GMP信号通路在荧光假单胞菌PF08生物膜形成中的关键作用，还为开发靶向生物膜的食品防腐策略提供了新的分子靶点，同时建立的筛选方法可推广应用于其他微生物的生物膜调控基因研究。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪在本研究中用于实时、连续监测野生型荧光假单胞菌PF08及其三个基因缺失突变体（ΔDR105、ΔDR690、ΔDR705）的生长动态，其测量的OD600值随时间变化的生长曲线（图2B）具有以下关键研究意义：
校正基因缺失对细菌生长的背景影响：生长曲线清晰显示，ΔDR690突变体在培养8小时后生长速率显著高于野生型，进入稳定期后生长差距进一步扩大，而ΔDR105和ΔDR705的生长曲线与野生型基本重合。这一结果表明D7M10_RS27690基因的缺失会特异性促进细菌生长，而另外两个基因的缺失对基础生长代谢无显著影响。在后续的c-di-GMP定量、生物膜生物量、铁载体产量等所有表型实验中，必须扣除生长背景的差异才能准确反映基因缺失的真实效应。例如，ΔDR690突变体的c-di-GMP含量是野生型的3.4倍，这一结果是在标准化到单位细胞数量后计算得到的，确保了数据的准确性和可比性。
确定后续实验的最佳采样时间窗口：生长曲线完整呈现了细菌的延迟期、对数期和稳定期特征。本研究中生物膜培养24小时、铁载体培养过夜以及转录组分析的采样时间点，均是基于生长曲线确定的。例如，24小时对应细菌稳定期早期，此时生物膜形成达到较高水平且未进入老化阶段，能够最准确地反映不同菌株的生物膜形成能力差异。同时，ΔDR690突变体在8小时后进入快速生长期的特征，也为研究c-di-GMP对生长调控的时间动力学机制提供了重要参考。
揭示c-di-GMP与细菌生长的新型关联：生长曲线显示ΔDR690突变体的生长速率显著提升，而其胞内c-di-GMP水平也同步升高。这一发现首次在食品腐败菌荧光假单胞菌PF08中建立了c-di-GMP水平与细菌生长速率之间的正相关关系，拓展了对c-di-GMP信号通路功能的认知——它不仅是生物膜形成的核心调控因子，还参与细菌基础生长代谢的调控。这为理解细菌在游离态和生物膜态之间的生长-表型权衡机制提供了新线索。
验证基因缺失表型的特异性：ΔDR105和ΔDR705的生长曲线与野生型完全一致，说明这两个基因的功能局限于生物膜调控等特定生理过程，不影响细菌的基本生存能力。而ΔDR690的生长曲线差异则表明该基因可能参与更广泛的细胞代谢网络调控。这些结果为后续的功能研究提供了重要的表型边界，确保了实验结论的特异性和可靠性。
为实际食品防腐应用提供量化参考：生长曲线数据量化了不同c-di-GMP水平下细菌的生长速率，而生长速率直接决定了食品的腐败速度。这一结果为开发靶向c-di-GMP通路的食品防腐策略提供了关键依据：例如，通过抑制PDE活性提高c-di-GMP水平，虽然会促进生物膜形成，但同时也会加速细菌生长，可能需要结合其他杀菌手段；而通过激活PDE活性降低c-di-GMP水平，则可以抑制生物膜形成并使细菌保持游离态，便于采用物理或化学方法进行杀灭。