Molecular Mechanisms and Antioxidant Effects of Latilactobacillus sakei F1, Lacticaseibacillus paracasei D2, Lacticaseibacillus rhamnosus JL, and Weissella cibaria JLK Isolated from Spontaneously Fermented and Raw Food Product
从自发发酵及生食产品中分离的清酒乳杆菌F1、副干酪乳杆菌D2、鼠李糖乳杆菌JL、食魏斯氏菌JLK的分子机制与抗氧化效应
来源：Foods 2025, 14, 3395.
1.摘要
本研究从发酵食品与生食蔬菜中分离得到50株乳酸菌，通过DPPH、ABTS自由基清除实验筛选出4株抗氧化性能突出的菌株：清酒乳杆菌F1、副干酪乳杆菌D2、鼠李糖乳杆菌JL、食魏斯氏菌JLK。进一步测定其过氧化氢耐受性，并结合全基因组测序与转录组分析，探究抗氧化分子机制。结果显示，副干酪乳杆菌D2与鼠李糖乳杆菌JL主要通过NADH氧化酶-过氧化物酶系统、硫氧还蛋白系统、谷胱甘肽过氧化物酶系统应对氧化应激；清酒乳杆菌F1是唯一携带过氧化氢酶基因*katE*的菌株，在H₂O₂胁迫下*katE*显著上调，同时二氢乳清酸脱氢酶大幅高表达；食魏斯氏菌JLK仅*npx*基因轻微上调，主要依赖非酶促抗氧化途径。四株菌均表现出强抗氧化活性与氧化耐受能力，可作为开发抗氧化功能性食品的优质益生菌候选菌株。
2.关键词（中文）
乳酸菌、抗氧化、氧化应激、过氧化氢、自由基清除、益生菌、分子机制、热灭活菌
3.研究目的
从天然发酵与生食样品中筛选具有高抗氧化活性的乳酸菌。
比较活菌与热灭活菌的自由基清除能力差异。
评价菌株对过氧化氢（H₂O₂）氧化胁迫的耐受性。
解析四株乳酸菌抗氧化的分子通路与关键功能基因。
明确不同菌株抗氧化机制的差异性，为功能性益生菌开发提供依据。
4.研究思路
采用“菌株分离→抗氧化筛选→耐受评价→基因组分析→转录组验证→机制区分”的完整路线。先分离纯化乳酸菌，MALDI-TOF MS鉴定；检测活菌/热灭活菌的DPPH、ABTS清除能力；测定不同H₂O₂浓度下的生长耐受性；对优选菌株进行全基因组测序，注释抗氧化相关基因；利用Bioscreen测定氧化胁迫下生长曲线；提取对数期与稳定期RNA，转录组定量关键抗氧化基因表达；最终区分各菌株的抗氧化分子机制。
5.研究亮点
首次系统比较4个属/种乳酸菌的抗氧化表型与分子机制，揭示菌株特异性通路。
证实清酒乳杆菌F1为唯一含*katE*过氧化氢酶基因的菌株，具有独特抗氧化策略。
发现鼠李糖乳杆菌JL独有*nox*（NADH氧化酶），与*npx*共同构成高效H₂O₂清除系统。
证明活菌抗氧化整体优于热灭活菌，但部分菌株热死菌仍保留显著活性。
阐明食魏斯氏菌JLK不依赖经典抗氧化酶，主要依靠非酶促方式发挥作用。
6.可延伸的方向
探究四株菌体外抗氧化、抗炎、肠道屏障保护的协同作用。
开展动物实验验证体内抗氧化、延缓衰老、改善氧化相关慢病效果。
挖掘清酒乳杆菌F1中二氢乳清酸脱氢酶间接抗氧化的具体分子通路。
构建*katE*、*nox*、*npx*等基因缺失/回补株，验证功能必要性。
开发复合益生菌剂，实现广谱、高效、稳定的天然抗氧化效果。
研究胞外多糖、肽类等非酶促成分对抗氧化的贡献。
7.测量的数据及其研究意义
50株乳酸菌的DPPH与ABTS自由基清除率数据，来自图1、图2、表2。意义：筛选出抗氧化能力最强的前8株菌，确定F1、D2、JL、JLK为最优菌株。
四株菌在不同H₂O₂浓度下的生长曲线数据，来自图3a–d。意义：明确各菌株氧化耐受阈值，D2/JL/JLK耐受1–3 mM，F1可耐受高达4 mM。
四株菌基因组基本特征（大小、GC含量、登录号）数据，来自表3。意义：提供基因组背景，支持基因注释与比较分析。
抗氧化相关基因（*npx*、*nox*、*tpx*、*trxB*、*gpx*、*gshR*、*sodA*、*katE*）分布数据，来自表4。意义：揭示四株菌抗氧化基因组成差异，为机制解释奠定基础。
H₂O₂胁迫下抗氧化基因相对表达量数据，来自表5。意义：证实D2、JL在对数期显著上调*npx*、*nox*、*tpx*、*gpx*；F1上调*katE*；JLK仅轻微上调*npx*。
8.结论
清酒乳杆菌F1、副干酪乳杆菌D2、鼠李糖乳杆菌JL、食魏斯氏菌JLK均具有强DPPH、ABTS自由基清除能力与H₂O₂耐受性。
-副干酪乳杆菌D2、鼠李糖乳杆菌JL：依赖NADH氧化酶-过氧化物酶、硫氧还蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶三大系统应对氧化应激，对数期基因上调最显著。
-清酒乳杆菌F1：唯一含*katE*，过氧化氢酶为核心防线，同时二氢乳清酸脱氢酶大幅上调，通过间接 redox 平衡增强抗氧化。
-食魏斯氏菌JLK：缺乏*katE*、*nox*，经典抗氧化酶上调微弱，主要依赖非酶促机制发挥抗氧化作用。
四株菌是开发天然抗氧化功能性食品与益生菌制剂的理想候选菌株。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C全自动生长分析仪，37℃培养，每3小时测定OD₆₀₀，连续监测40 h，获得四株乳酸菌在0–8 mM H₂O₂氧化胁迫下的生长动力学曲线，数据来自图3a–d。
研究意义：
精准量化氧化胁迫耐受性：生长曲线直观显示H₂O₂浓度升高导致延滞期延长、生长速率下降、最大生物量降低，准确定义各菌株的耐受上限：D2/JL/JLK为3 mM，F1高达4 mM，为后续转录组取样浓度提供科学依据。
排除生长缺陷干扰：确认四株菌在无胁迫条件下生长健壮、稳定，证明抗氧化差异源于代谢与基因调控，而非基础生长能力差异。
确定取样时间窗口：通过生长曲线明确对数中期与稳定初期为基因表达关键期，保证转录组样本处于氧化应答最活跃阶段，结果更可靠。
揭示胁迫响应动态：曲线显示F1在高浓度H₂O₂下仍能恢复生长，直观体现其超强氧化耐受，与*katE*存在的分子特征相互印证。
高通量、高重复、标准化：多浓度、多重复自动测定，消除人工操作误差，为氧化耐受表型提供客观、可重复的定量数据，是连接表型与分子机制的核心支撑。