The Role of ccpA in Nitrogen Source-Induced Heat and Oxidative Stress Tolerance Changes in Lacticaseibacillus rhamnosus
ccpA在氮源诱导的鼠李糖乳杆菌热胁迫与氧化胁迫耐受性变化中的作用
来源：Foods 2025, 14, 3894.
1.摘要
本研究以鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301及其ccpA基因缺失株ΔccpA为对象，探究ccpA在不同氮源条件下对菌体热胁迫和氧化胁迫耐受性的调控作用。结果显示，ΔccpA在MRS培养基中生长变慢、耐热性下降，但抗氧化胁迫能力显著提升；转录组表明缺失ccpA主要影响碳源转运与代谢相关基因，不调控典型胁迫基因。去除胰蛋白胨可提升野生型菌株耐热与抗氧化性，而ΔccpA不再响应氮源变化产生抗氧化差异，说明氮源诱导的氧化胁迫耐受性完全依赖ccpA。ccpA可同时影响碳氮代谢，重塑糖酵解、丙酮酸代谢、嘌呤/嘧啶/脂肪酸合成通路，进而决定菌体胁迫表型。本研究从代谢调控角度揭示了鼠李糖乳杆菌胁迫耐受的新机制。
2.关键词（中文）
鼠李糖乳杆菌、ccpA、碳分解代谢阻遏、氮源、热胁迫、氧化胁迫、耐受性、转录组
3.研究目的
明确ccpA基因对鼠李糖乳杆菌生长、耐热性、抗氧化性的影响。
揭示氮源（胰蛋白胨）对菌株胁迫耐受性的调控规律。
阐明ccpA是否介导氮源诱导的热胁迫与氧化胁迫耐受性变化。
利用转录组解析ccpA与氮源共同调控胁迫耐受的分子通路。
为提高益生菌在生产、干燥、储存中的存活稳定性提供理论依据。
4.研究思路
构建ccpA缺失株ΔccpA及回补株；在普通MRS与无胰蛋白胨NP-MRS中培养；用Bioscreen测定生长曲线；检测不同温度、H₂O₂浓度下的存活率；比较野生型与ΔccpA的转录组差异；分析碳代谢、脂肪酸、嘌呤/嘧啶、胁迫基因表达；外加胞嘧啶验证核苷酸代谢对胁迫的影响；最终阐明ccpA介导氮源调控胁迫耐受的机制。
5.研究亮点
首次证实氮源诱导的氧化胁迫耐受性完全依赖ccpA，耐热性则不依赖ccpA。
发现ccpA缺失导致“耐热下降、抗氧化上升”的双向表型。
揭示ccpA不通过经典热激基因（dnaK/groEL）调控耐热，而是通过代谢重编程发挥作用。
阐明嘌呤合成、嘧啶合成、脂肪酸合成受ccpA与氮源共同调控。
证明添加胞嘧啶可降低热/氧化胁迫耐受性，首次将核苷酸代谢与胁迫表型关联。
6.可延伸的方向
探究NADH/NAD⁺氧化还原平衡在ccpA调控抗氧化中的具体作用。
分析ccpA对细胞膜脂肪酸组成的影响，揭示膜流动性与胁迫耐受的关系。
研究其他氮源（氨基酸、多肽）对ccpA介导胁迫耐受的影响。
构建ccpA温和表达菌株，平衡生长速率与氧化耐受性。
结合代谢组揭示ccpA缺失后胞内代谢物变化与胁迫耐受的关联。
开发基于低氮培养+ccpA调控的高稳定益生菌制备工艺。
7.测量的数据及其研究意义
ccpA缺失与回补的PCR验证数据，来自图1a。意义：确认基因敲除与回补成功。
野生型、ΔccpA、回补株的生长曲线数据，来自图1b。意义：ccpA缺失导致生长变慢、稳定期延迟，回补可恢复。
不同温度热处理后的活菌数与存活率数据，来自图2a、图4a–d。意义：ccpA正向调控耐热性；无胰蛋白胨可提升耐热，且该效应不依赖ccpA。
不同H₂O₂处理后的活菌数与存活率数据，来自图2b、图5a–d。意义：ccpA负调控抗氧化；无胰蛋白胨提升抗氧化的效应完全依赖ccpA。
转录组差异基因KEGG富集数据，来自图3a。意义：ccpA主要调控PTS、果糖甘露糖代谢、丙酮酸代谢、脂肪酸合成等通路。
丙酮酸代谢与糖酵解关键基因表达数据，来自图3b、图6a。意义：ccpA抑制糖异生、调控乙酸生成支路，影响氧化还原平衡。
热激相关基因表达数据，来自图6b。意义：dnaK、groEL受氮源调控，但不受ccpA影响。
嘧啶、嘌呤、脂肪酸合成操纵子表达数据，来自图7a–c。意义：这些通路受ccpA与氮源共同调控。
glmS己糖胺合成基因表达数据，来自图7d。意义：glmS受ccpA与氮源协同调控，影响细胞壁合成。
外加胞嘧啶对热/氧化胁迫存活率影响数据，来自图8a、b。意义：胞嘧啶降低胁迫耐受性，提示核苷酸代谢参与调控。
8.结论
ccpA是鼠李糖乳杆菌的核心碳代谢调控因子，可加快生长、提高耐热性、降低抗氧化性。
去除胰蛋白胨（低氮）可同时提升耐热与抗氧化能力；其中抗氧化提升完全依赖ccpA，耐热提升不依赖ccpA。
ccpA不调控经典热激/氧化基因，而是通过重编程碳转运、糖代谢、丙酮酸代谢、脂肪酸、嘌呤/嘧啶合成实现胁迫调控。
嘌呤合成上调、嘧啶合成下调与低氮诱导的胁迫耐受相关；胞嘧啶可逆转该表型。
ccpA是连接碳氮代谢与胁迫耐受的关键枢纽，可作为改造益生菌稳定性的靶点。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C全自动生长分析仪，37℃静态培养，连续监测OD₆₀₀，获得野生型、ΔccpA、回补株在MRS中的生长曲线，数据来自图1b。
研究意义：
直观揭示ccpA对生长的核心作用：曲线清晰显示ΔccpA延滞期更长、生长速率更低、稳定期推迟约10小时，最终生物量不变，证明ccpA主要加快生长速率，不影响总生物量。
验证回补株功能恢复：两种回补株曲线均恢复至野生型水平，证明ccpA是导致生长表型的唯一原因，排除其他突变干扰。
为胁迫实验提供统一生理状态：根据生长曲线确定OD₆₀₀=1.8–2.0为对数中期，保证热/氧化处理时所有菌株处于相同生长阶段，避免因生长差异导致存活率误判。
支持转录组取样可靠性：按曲线确定取样时间点，确保野生型与突变体在生理等效状态下提取RNA，使转录组差异真实反映基因调控，而非生长阶段差异。
高通量、高重复、标准化：多组平行自动监测，消除人工操作误差，为表型分析提供客观、可重复的基础数据，是连接基因型与胁迫表型的关键依据。