Synthesis and Biological Evaluation of Disulfides Based on Garlic Extract as Type III Secretion System Inhibitors against Erwinia amylovora
基于大蒜提取物的二硫化物衍生物合成及作为Ⅲ型分泌系统抑制剂抗梨火疫病菌的生物学评价
来源：J. Agric. Food Chem. 2025, 73, 12582−12590
1.摘要
梨火疫病由梨火疫欧文氏菌（*Erwinia amylovora*）引起，严重威胁蔷薇科果树生产。Ⅲ型分泌系统（T3SS）是该菌关键致病因子，可向植物细胞分泌效应蛋白引发病害。本研究以大蒜提取物中的二硫键活性结构为母体，设计合成39个二硫化物小分子，利用*lux*发光报告系统高通量筛选T3SS抑制剂。结果显示，化合物5c能显著抑制T3SS核心基因hrpA和hrpL的启动子活性，且不影响细菌生长；可显著抑制烟草过敏性坏死反应（HR），降低HrpN致病蛋白分泌量，并在梨花、果实、叶片、嫩梢接种实验中明显减轻病症，防效优于阳性对照苯甲酸。转录组与qPCR证实，5c显著下调T3SS调控与结构基因表达。该研究为开发防控梨火疫病的新型无毒抑菌剂提供了先导化合物与理论依据。
2.关键词（中文）
梨火疫欧文氏菌、Ⅲ型分泌系统、梨火疫病、二硫化物、抑制剂
3.研究目的
以大蒜活性成分为模板，合成稳定、高效的二硫化物衍生物。
筛选不杀伤细菌、仅靶向抑制T3SS的安全型抗毒力小分子。
验证候选化合物对*E. amylovora*致病能力的抑制效果。
阐明化合物抑制T3SS的分子机制，获得可用于防治梨火疫病的先导化合物。
4.研究思路
以大蒜素、二烯丙基二硫醚等含二硫键天然产物为骨架，设计合成6系列共39个对称/不对称二硫化物；构建hrpA-lux和hrpL-lux启动子报告菌株，高通量筛选抑制T3SS的化合物；利用芬兰Bioscreen测定生长曲线，排除抑菌化合物；通过烟草HR反应、HrpN分泌检测、梨果实/花/叶片/嫩梢致病性测定，评价体内外抑毒效果；结合转录组与qPCR，解析5c对T3SS基因网络的调控机制。
5.研究亮点
首次将大蒜来源二硫化物改造为T3SS抑制剂，天然低毒、环境友好。
建立双报告基因（hrpA/hrpL）高通量筛选体系，精准、高效。
化合物5c不杀菌、只抑毒，不易产生耐药性，符合绿色防控理念。
5c在多个梨组织部位均显著控病，效果优于苯甲酸，成药潜力高。
完整阐明作用通路：通过下调HrpL全局调控因子，广谱抑制T3SS。
6.可延伸的方向
对5c进行结构优化，提高水溶性、稳定性与防效。
开展温室/田间药效试验，评估实际应用价值。
探究5c对其他植物病原细菌T3SS的广谱抑制活性。
解析5c与靶标蛋白（HrpS、HrpL、HrpA）的互作位点。
开发5c与杀菌剂、生防菌的复配制剂。
研究5c对细菌群体感应、胞外多糖、生物膜的协同调控。
7.测量的数据及其研究意义
39个化合物对hrpA启动子活性抑制数据，来自图3。意义：筛选出11个高活性候选化合物，为后续验证提供对象。
11个候选化合物对hrpL启动子活性抑制数据，来自图4。意义：证明候选物同时抑制核心调控基因，作用于T3SS上游。
化合物处理下*E. amylovora*在LB和HMM培养基的生长曲线数据，来自图5A、图5B。意义：排除抑菌干扰，确认4c、4g、5b、5c、5e、5g、5h为特异性抑毒化合物。
化合物对烟草过敏性坏死（HR）的抑制数据，来自图6A–G。意义：确定5c为最优抑制剂，可完全阻断T3SS介导的非寄主反应。
5c处理后梨花朵、果实、叶片、嫩梢的发病程度数据，来自图7A–F。意义：证实5c在真实寄主上显著降低致病性，防效突出。
转录组差异基因与KEGG富集数据，来自图8A、图8B。意义：证明5c显著下调分泌系统通路，不影响基础代谢。
qPCR检测8个T3SS相关基因表达数据，来自图8C。意义：验证5c下调hrpL、hrpA、hrpN、dspE等关键基因。
HrpN蛋白分泌量Western blot数据，来自图9。意义：直接证明5c降低致病效应蛋白输出，是减毒关键。
8.结论
成功合成39个大蒜源二硫化物，筛选出高选择性T3SS抑制剂5c。
5c不影响梨火疫病菌生长，特异性抑制hrpA和hrpL启动子，阻断T3SS功能。
5c显著抑制烟草HR反应，减少HrpN致病蛋白分泌。
在梨的花、果实、叶片、嫩梢上均显著降低致病性，防效优于苯甲酸。
5c通过全局下调T3SS调控与结构基因实现减毒，是理想的抗毒力先导化合物。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C全自动生长分析仪，在28℃条件下每3小时测定OD₆₀₀，连续监测48小时，获得*Erwinia amylovora* CFBP1430在LB培养基（图5A）和T3SS诱导HMM培养基（图5B）中分别加入39种化合物的生长曲线。
其核心研究意义如下：
严格区分“抑菌”与“抑毒”：T3SS抑制剂理想特性为不杀伤细菌、仅降低毒力，避免耐药性。生长曲线直接显示：4c、4g、5b、5c、5e、5g、5h处理组与DMSO对照组曲线完全重合，无生长抑制；而3b、4e、4f、5a表现抑菌作用，被排除。这一步确保最终得到的是特异性抗毒力化合物。
统一生理背景，保证结果可靠：在富营养LB和诱导T3SS的HMM两种培养基中均验证无生长影响，排除营养依赖的假阳性。
高通量、标准化、可重复：100孔板同步测定，自动读数，避免人工误差，为39个化合物快速筛选提供统一标准。
为后续机制实验奠定基础：确认化合物不改变生长速率、稳定期OD、延迟期，保证转录组、蛋白分泌、致病性测定中菌量一致，结论可信。
符合抗毒力策略核心要求：不杀菌→不产生选择压力→不易耐药，是新型绿色农药的关键指标，Bioscreen数据为此提供了定量、客观、可视化的证据。