Isolation and Purification of Extracellular Inhibitory Products from Bacillus velezensis YJ0-1 and Optimization of Fermentation Medium
贝莱泽芽孢杆菌YJ0-1胞外抑制产物的分离纯化及发酵培养基优化
来源：Medium. Fermentation 2025, 11, 595
1.摘要
大豆是全球重要的经济作物，核盘菌引起的大豆菌核病严重威胁其产量和品质，传统化学防治面临环境污染、病原菌抗药性等问题。本研究从中国东北落叶松根际土壤中分离得到的贝莱泽芽孢杆菌YJ0-1对核盘菌具有显著拮抗作用，其发酵液酸沉淀粗提物表现出强抗真菌活性。通过酸沉淀、蛋白纯化系统分离和高分辨质谱鉴定，确定核心抗菌物质为丰霉素（fengycin，分子式C₇₂H₁₁₀N₁₂O₂₀，分子量1463.8 Da）。采用单因素实验和Box-Behnken响应面法对PDB基础培养基进行优化，得到最优配方为蛋白胨66.62 g/L、蔗糖32.68 g/L、pH 6.5。验证实验显示，丰霉素实际产量达2.03 g/L，与模型预测值2.04 g/L的相对误差仅0.49%，合成效率显著提升。本研究为大豆菌核病的生物防治提供了新的微生物资源和理论依据，也为丰霉素的工业化生产奠定了技术基础。
2.关键词（中文）
贝莱泽芽孢杆菌、核盘菌、丰霉素、生物防治、培养基优化
3.研究目的
分离纯化贝莱泽芽孢杆菌YJ0-1发酵液中的胞外抗菌活性物质，鉴定其化学结构和生物学特性（热稳定性、抑菌活性）。
系统优化发酵培养基配方，提高核心抗菌物质丰霉素的合成效率，建立高产发酵工艺。
建立高效的丰霉素分离纯化方法和精准的HPLC定量检测体系，为后续工业化生产提供技术支撑。
评估丰霉素作为生物农药的应用潜力，为大豆菌核病的绿色防控提供新的解决方案。
4.研究思路
采用“活性追踪-分离纯化-结构鉴定-培养基优化-活性验证”的递进式研究路线。首先通过酸沉淀法从YJ0-1发酵液中制备粗提物，利用G-10葡聚糖凝胶柱进行色谱分离，结合全波长扫描和琼脂扩散法抑菌活性追踪，定位活性组分；通过高效液相色谱（HPLC）进一步纯化，采用高分辨质谱（HRMS）对活性组分进行结构鉴定；测定纯化丰霉素的抑菌活性和热稳定性，评估其应用潜力。以PDB为基础培养基，通过单因素实验筛选最优氮源、碳源、浓度范围和初始pH，再利用Box-Behnken响应面法分析各因素的交互作用，建立回归模型并预测最优培养基配方；最后通过验证实验确认优化效果，并使用芬兰Bioscreen C生长曲线分析仪测定不同条件下菌株的生长动力学，解析菌株生长与丰霉素合成的关系。
5.研究亮点
首次从东北寒地土壤分离的贝莱泽芽孢杆菌YJ0-1中鉴定出高活性丰霉素，其对核盘菌的抑制率达65%，且具有优异的热稳定性（121℃高压灭菌20 min后抗菌活性完全保留），解决了多数生防物质热稳定性差的问题。
仅通过培养基优化实现了丰霉素的高产，产量达2.03 g/L，显著高于多数野生型芽孢杆菌的报道水平，无需基因工程改造，具有工业化应用的低成本和易推广优势。
建立了基于酸沉淀-凝胶过滤色谱的高效分离纯化方法，纯化后丰霉素纯度高（HPLC单峰），同时构建了线性范围宽（0.001-0.01 g/mL）、相关性好（R²=0.9992）的HPLC定量检测方法。
系统解析了营养因素对丰霉素合成的调控规律，发现pH与蔗糖的交互作用对产量影响最显著，明确了高浓度营养通过渗透压胁迫和代谢副产物积累抑制丰霉素合成的机制。
揭示了菌株生长与丰霉素合成的耦合关系，优化后的培养基在缩短延迟期、提高生物量的同时，显著促进了次级代谢产物的合成，实现了生长与产素的协同提升。
6.可延伸的方向
丰霉素分子作用机制研究：结合转录组学、代谢组学和细胞生物学技术，解析丰霉素对核盘菌细胞膜通透性、细胞壁合成和细胞凋亡的影响，明确其分子作用靶点。
发酵工艺放大与优化：在摇瓶优化基础上，开展5 L、50 L发酵罐中试实验，优化溶氧、搅拌转速、补料策略和温度控制等工艺参数，实现规模化稳定生产。
菌株代谢工程改造：通过CRISPR-Cas9技术敲除竞争代谢途径、过表达丰霉素合成关键NRPS基因簇和调控基因，进一步突破产量瓶颈。
生物农药制剂开发：将YJ0-1活菌或纯化丰霉素制备成可湿性粉剂、悬浮剂、微胶囊剂等商品化剂型，优化助剂配方，提高田间持效期和抗逆性。
田间应用与安全性评价：开展不同生态区、不同大豆品种的田间防效试验，评估其对大豆菌核病的防治效果、对非靶标生物的安全性及环境残留风险。
抗菌谱拓展研究：测试丰霉素对灰霉菌、镰刀菌、疫霉菌等其他重要植物病原真菌的拮抗活性，拓展其在多种作物病害防治中的应用。
复合生防制剂研发：将YJ0-1与木霉菌、假单胞菌等生防菌或腐植酸、壳聚糖等生物刺激素复配，发挥协同增效作用，提升综合防治效果。
7.测量的数据及其研究意义
粗提物的凝胶过滤色谱洗脱峰数据，来自图1。意义：明确粗提物中主要包含两个组分，其中9 min的峰1为高丰度组分，为后续活性追踪和分离纯化提供了方向。
粗提物的全波长扫描光谱数据，来自图2。意义：确定活性组分的特征吸收波长为230 nm，为HPLC检测参数的设置提供了依据，确保了定量检测的准确性。
不同时间收集组分的抑菌活性数据，来自图3和图4。意义：追踪到抗菌活性集中在9-11 min的洗脱液中，其中9 min组分的抑制率最高（65%），验证了峰1为目标活性组分。
纯化组分的HPLC色谱图数据，来自图5。意义：证明分离得到的活性组分纯度高，仅出现单一主峰，排除了杂质干扰，为后续质谱鉴定奠定了基础。
纯化组分的热稳定性实验数据，来自图6。意义：证实丰霉素具有优异的热稳定性，121℃处理20 min后活性不变，适合工业化生产中的高温灭菌工艺。
纯化组分的高分辨质谱数据，来自图7。意义：确定活性物质的精确分子量为1463.8 Da，分子式为C₇₂H₁₁₀N₁₂O₂₀，准确鉴定其为丰霉素。
丰霉素的HPLC标准曲线数据，来自图8。意义：建立了丰霉素的定量检测方法，线性关系良好（R²=0.9992），为后续培养基优化中的产量测定提供了可靠的定量手段。
单因素实验的丰霉素产量数据，来自图9。意义：筛选出最优氮源为蛋白胨、最优碳源为蔗糖，确定了蛋白胨、蔗糖的最佳浓度范围和初始pH 6.0，为响应面优化的因素和水平设置提供了依据。
不同单因素条件下菌株的生长曲线数据，来自图10。意义：分析了氮源、碳源、浓度和pH对菌株生长的影响，明确了生长与丰霉素合成的相关性，排除了生长缺陷导致的产量差异。
响应面实验的因素水平设计和实验结果数据，来自表1和表2。意义：通过15组实验系统考察了pH、蛋白胨、蔗糖三个因素及其交互作用对丰霉素产量的影响。
响应面模型的拟合统计数据，来自表3和表4。意义：验证了回归模型的显著性（p=0.0209）和可靠性，调整R²=0.8011，预测R²=0.6181，信噪比8.481，表明模型具有良好的预测能力。
响应面模型的方差分析数据，来自表5。意义：明确了pH与蔗糖的交互作用（AC）、蛋白胨的二次项（B²）和蔗糖的二次项（C²）对产量影响显著（p<0.05），为最优配方的确定提供了统计学依据。
各因素交互作用的响应面和等高线图数据，来自图11。意义：直观展示了pH与蛋白胨、pH与蔗糖、蛋白胨与蔗糖之间的交互作用，确定了各因素的最优取值范围。
最优条件预测和验证实验数据，来自表6。意义：得到了理论最优培养基配方，验证实验的实际产量与预测值的相对误差仅0.49%，证明了模型的准确性和优化方案的有效性。
8.结论
贝莱泽芽孢杆菌YJ0-1对核盘菌具有显著的拮抗作用，其核心抗菌物质为丰霉素（C₇₂H₁₁₀N₁₂O₂₀，分子量1463.8 Da），该物质具有优异的热稳定性，121℃高压灭菌20 min后抗菌活性保持不变。
建立了“酸沉淀-凝胶过滤色谱-HPLC纯化”的丰霉素高效分离纯化方法，以及线性范围宽、准确性高的HPLC定量检测体系，为丰霉素的制备和分析提供了技术支撑。
通过单因素实验和Box-Behnken响应面法优化得到最优PDB培养基配方：蛋白胨66.62 g/L、蔗糖32.68 g/L、pH 6.5，在此条件下丰霉素产量达2.03 g/L，与模型预测值高度一致。
氮源、碳源和pH对丰霉素合成具有显著调控作用，其中pH与蔗糖的交互作用最为关键，过高或过低的营养浓度和pH都会通过渗透压胁迫或代谢失衡抑制丰霉素的合成。
菌株生长与丰霉素合成呈正相关但非完全线性关系，优化后的培养基在促进菌株快速生长、提高生物量的同时，显著增强了丰霉素的合成能力。
本研究获得的YJ0-1菌株和优化的发酵工艺，为大豆菌核病的绿色生物防治提供了新的微生物资源，也为丰霉素的工业化生产和应用奠定了重要基础。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪（Version 1.0.6.5），在30℃恒温条件下，自动连续监测72 h，测定600 nm波长处的光密度（OD₆₀₀），获得了贝莱泽芽孢杆菌YJ0-1在不同氮源组合、不同碳源组合、不同蔗糖浓度、不同蛋白胨浓度和不同初始pH条件下的完整生长动力学曲线，数据来自图10a-e。其研究意义主要体现在以下六个方面：
排除生长差异对产量的干扰：这是该实验最核心的作用。在培养基优化中，丰霉素产量的差异可能源于菌株生长能力的不同，而非培养基对次级代谢的直接调控。Bioscreen的连续监测证实，所有测试条件下菌株均能正常生长并进入稳定期，且丰霉素产量最高的条件（蛋白胨3 g/50 mL、蔗糖1 g/50 mL、pH 6.0）对应着菌株最高的生物量和最快的生长速率。这一结果明确了培养基优化对产量的提升是通过同时促进菌株生长和次级代谢实现的，而非单纯的生长差异导致，为产量差异的归因提供了关键依据。
揭示营养条件对菌株生长的调控规律：生长曲线清晰展示了不同营养参数对菌株生长的影响。例如，以蛋白胨为唯一氮源时，菌株的延迟期更短、对数生长期更长、最终生物量更高，而添加尿素会显著抑制生长，这与丰霉素产量的变化趋势完全一致，说明蛋白胨既是丰霉素合成的优质氮源，也是菌株生长的良好营养物质。同时，高浓度蔗糖（6 g/50 mL）和蛋白胨（8 g/50 mL）会导致菌株生长速率下降，解释了过高营养浓度通过渗透压胁迫和代谢副产物积累抑制丰霉素合成的机制。
确定最佳发酵终止时间：丰霉素作为次级代谢产物，通常在菌株生长的稳定期大量合成。生长曲线显示，YJ0-1在接种后约12 h进入对数生长期，36 h左右进入稳定期，72 h时仍处于稳定期且生物量未下降。这一结果确定了72 h为最佳发酵终止时间，此时丰霉素的积累量达到峰值，为后续工业化发酵的时间控制提供了精准依据，避免了过早终止导致的产量不足或过晚终止导致的资源浪费。
验证培养基优化方案的合理性：优化后的培养基不仅显著提高了丰霉素产量，也大幅改善了菌株的生长性能。与基础PDB培养基相比，最优培养基条件下菌株的延迟期缩短了约4 h，最大生物量提高了约30%。这一结果验证了培养基优化方案的科学性，说明通过调整碳氮比和pH，可以同时满足菌株生长和次级代谢产物合成的营养需求，实现了“生长-产素”的协同优化。
为发酵工艺放大提供基础动力学参数：Bioscreen测定的比生长速率、延迟期时间、最大生物量等动力学参数，是发酵罐放大设计和过程控制的核心基础数据。这些参数可用于建立发酵过程的数学模型，预测不同规模发酵罐中菌株的生长动态，进而优化搅拌转速、通气量、补料时间和补料速率等工艺参数，确保工业化生产中菌株生长和产物合成的稳定性，降低放大过程中的风险。
解析生长与产物合成的耦合关系：通过对比不同条件下的生长曲线和对应的丰霉素产量，发现两者呈正相关但并非完全线性。例如，在pH 5.5和pH 8.0的条件下，菌株的生物量与pH 6.0时相差不大，但丰霉素产量却下降了30%以上。这一结果表明，pH对丰霉素合成的调控不仅通过影响菌株生长实现，还直接作用于丰霉素合成相关基因的表达或关键酶的活性，为后续深入研究丰霉素合成的分子调控机制提供了重要线索。