Inhibitive and prophylactic efficacy of lactic acid bacteria from Apis mellifera (Hymenoptera: Apidae) in combating Paenibacillus infections
西方蜜蜂（膜翅目：蜜蜂科）乳酸菌在抗击类芽孢杆菌感染中的抑制和预防作用
来源：Journal of Apicultural Research, 64:2, 701-712
1.摘要
随着蜜蜂细菌性疾病生物防治替代方法的需求日益增长，开发基于益生菌的蜜蜂生长、免疫功能和防御增强策略具有重要意义。蜜蜂拥有丰富的微生物组，其中乳酸菌是其核心组成部分。本研究从健康西方蜜蜂中分离鉴定了蜜蜂乳杆菌属（Apilactobacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）和肠球菌属（Enterococcus）菌株，评估了其作为美洲和欧洲幼虫腐臭病防控替代产品的潜力。通过培养和分子生物学方法完成菌株鉴定，采用琼脂塞扩散法和琼脂孔扩散法测试其对幼虫类芽孢杆菌（Paenibacillus larvae）和蜂房类芽孢杆菌（Paenibacillus alvei）的抗菌活性，利用Bioscreen C法测定72小时无细胞上清液对P. larvae孢子萌发的抑制作用，并在蜜蜂幼虫中测试了菌株对P. larvae孢子感染的预防效果。结果表明，分离的乳酸菌菌株对类芽孢杆菌具有强效抗菌活性，其无细胞上清液能显著抑制P. larvae孢子萌发；Apilactobacillus和Leuconostoc菌株不影响幼虫健康，Apilactobacillus和Enterococcus定殖的幼虫能在一定程度上清除临床感染，但单次给药的整体预防效果有限。这些菌株表现出的强效抗菌活性和对幼虫存活、体重的无负面影响，使其在美洲幼虫腐臭病早期感染治疗中具有良好的应用前景。
2.关键词（中文）
美洲幼虫腐臭病、抗菌剂、蜜蜂乳杆菌属、西方蜜蜂、微生物组、益生菌预防
3.研究目的
从土耳其不同地区的健康西方蜜蜂（工蜂和幼虫）样本中分离鉴定本土乳酸菌菌株，明确其分类地位和系统发育关系。
系统评估分离菌株对美洲幼虫腐臭病病原菌P. larvae（ERIC I、II、III三种基因型）和欧洲幼虫腐臭病相关病原菌P. alvei的体外抗菌活性，筛选高效广谱菌株。
测定乳酸菌72小时无细胞上清液对P. larvae营养体细胞生长和孢子萌发的抑制作用，明确其后生元抗菌潜力。
评价乳酸菌菌株在实验室饲养的蜜蜂幼虫中的安全性（对存活和体重的影响）以及对P. larvae孢子感染的预防效果。
探索本土乳酸菌作为蜜蜂细菌性疾病生物防治剂的可行性，为替代抗生素防控蜂病提供科学依据和种质资源。
4.研究思路
采用“菌株分离鉴定-体外抗菌活性评价-孢子萌发动态监测-体内幼虫安全性与预防实验”的递进式研究路线：首先采集健康蜜蜂样本，利用MRS选择性培养基分离乳酸菌，通过革兰氏染色、形态学观察和16S rRNA基因测序完成菌株鉴定和系统发育分析；其次采用琼脂塞扩散法（活菌）和琼脂孔扩散法（无细胞上清液），定量测定菌株对4种目标类芽孢杆菌的抑制圈直径，筛选抗菌活性菌株；然后利用芬兰Bioscreen C自动生长曲线仪，连续18小时动态监测无细胞上清液对P. larvae孢子萌发和营养体生长的影响，结合平板培养法验证杀孢子活性；最后建立实验室蜜蜂幼虫饲养体系，设置不同处理组，测定幼虫存活率、体重和感染情况，综合评估乳酸菌的安全性和预防效果，最终明确其作为蜂病生物防治剂的潜力。
5.研究亮点
首次系统分离鉴定了土耳其本土西方蜜蜂中的乳酸菌资源，获得6株具有抗菌活性的菌株，其中4株为Apilactobacillus kunkeei（优势种），1株为Leuconostoc mesenteroides，1株为Enterococcus faecium，丰富了全球蜜蜂益生菌的种质库。
同时评价了活菌（益生菌）和无细胞上清液（后生元）的双重抗菌活性，发现两者均对P. larvae和P. alvei有显著抑制作用，且SYM-5（A. kunkeei）和SYM-12（E. faecium）对所有测试的3种基因型P. larvae均有效，具有广谱抗菌特性。
采用Bioscreen C技术实现了对P. larvae孢子萌发过程的动态、定量监测，准确证明了除SYM-7外，其他5株乳酸菌的无细胞上清液能完全抑制孢子萌发，为其杀孢子活性提供了直接的动力学证据。
严格评估了乳酸菌对蜜蜂幼虫的安全性，明确Apilactobacillus和Leuconostoc菌株不影响幼虫的存活和体重，而Enterococcus菌株单独使用存在一定的安全性风险，为后续菌株筛选和应用提供了安全标准。
客观揭示了单次益生菌给药的局限性，同时发现部分菌株能在一定程度上减轻感染症状，为后续优化给药方案（如连续饲喂、复合菌株复配）提供了实验依据和改进方向。
6.可延伸的方向
分子机制解析：分离纯化乳酸菌产生的抗菌活性物质（如细菌素、有机酸、过氧化氢、肽类等），利用质谱和基因组测序鉴定其结构和合成基因簇，解析其抑制类芽孢杆菌生长和孢子萌发的分子靶点和作用机制。
给药方案优化：研究不同给药剂量、给药频率（单次vs连续）、给药时期（幼虫不同发育阶段）以及多菌株复配对预防效果的影响，建立高效的益生菌应用技术体系。
田间效果验证：开展规模化蜂群田间实验，评估这些乳酸菌在自然环境下对美洲和欧洲幼虫腐臭病的防控效果，以及对蜂群繁殖力、产蜜量和整体健康水平的长期影响。
肠道互作研究：利用16S rRNA测序和宏转录组技术，分析乳酸菌定殖对蜜蜂幼虫和成年蜂肠道微生物组结构和功能的影响，明确其通过调节肠道菌群增强蜜蜂免疫力的机制。
产品开发应用：开发基于这些乳酸菌的商业化蜂用益生菌产品，优化剂型（如花粉饼添加剂、糖浆包衣、喷雾制剂）和保存技术，延长产品保质期，提高田间使用便利性。
广谱活性拓展：测试这些乳酸菌对蜜蜂其他常见病原体（如蜜蜂残翅病毒、白垩病病原菌、瓦螨携带的病原菌）的抑制作用，拓展其应用范围。
抗性风险评估：长期监测乳酸菌使用后类芽孢杆菌耐药性的变化情况，评估其生态安全性，避免耐药菌株的产生和传播。
7.测量的数据及其研究意义
6株乳酸菌对3种基因型P. larvae和P. alvei的琼脂塞扩散和琼脂孔扩散抑制圈直径数据，来自表2。意义：定量比较了活菌和无细胞上清液的抗菌活性，筛选出SYM-5和SYM-12为广谱高效菌株，明确了不同菌株的抗菌谱和活性强度差异。
乳酸菌菌株对P. larvae的单独和协同拮抗活性平板照片，来自图1。意义：直观展示了乳酸菌在琼脂表面形成的清晰抑菌圈，证明其能有效抑制病原菌的生长，且多菌株组合具有协同抗菌效果。
不同处理组蜜蜂幼虫的存活数、死亡数、感染数、平均体重和健康幼虫比例数据，来自表3。意义：系统评估了各菌株的安全性和预防效果，证实A. kunkeei和L. mesenteroides对幼虫无负面影响，同时明确单次给药的预防效果有限，但部分菌株能提高感染幼虫的存活率。
P. larvae孢子在不同乳酸菌无细胞上清液处理下的18小时生长动力学曲线数据，来自补充图4（Sup. 4）。意义：动态监测了孢子萌发和营养体生长的全过程，直接证明除SYM-7外，其他菌株的上清液能完全抑制P. larvae孢子萌发，为其杀孢子活性提供了定量依据。
蜜蜂样本的采集地区信息，来自补充表1（Sup. 1）。意义：说明菌株的地理来源，保证了样本的代表性和区域适用性。
分离菌株的编号、来源、物种鉴定结果和GenBank登录号，来自补充表2（Sup. 2）。意义：提供了菌株的详细信息和序列可追溯性，便于其他研究者获取和验证实验结果。
6株乳酸菌的16S rRNA基因系统发育树，来自补充图3（Sup. 3）。意义：明确了各菌株的分类地位和进化关系，验证了分子生物学鉴定结果的准确性。
8.结论
从土耳其健康西方蜜蜂中成功分离鉴定出6株具有抗菌活性的乳酸菌，分属于Apilactobacillus kunkeei、Leuconostoc mesenteroides和Enterococcus faecium三个物种，其中A. kunkeei为优势种，占分离菌株的66.7%。
所有测试菌株的活菌均对P. larvae（ERIC I、II、III基因型）和P. alvei表现出显著的体外抗菌活性，其中SYM-5（A. kunkeei）对P. larvae ERIC I的抑制圈直径达18mm，SYM-12（E. faecium）对所有测试病原菌均有效。
乳酸菌的72小时无细胞上清液也具有抗菌活性，且除SYM-7外，其他5株菌株的上清液能完全抑制P. larvae孢子的萌发，显示出良好的后生元应用潜力。
实验室幼虫饲养实验表明，A. kunkeei和L. mesenteroides菌株对蜜蜂幼虫的存活和体重无负面影响，具有良好的生物安全性；而E. faecium SYM-12单独使用会显著降低幼虫存活率，存在一定的安全风险。
单次乳酸菌给药对P. larvae孢子感染的整体预防效果有限，但Apilactobacillus和Enterococcus菌株定殖的幼虫能在一定程度上清除临床感染，感染幼虫的存活率较阳性对照组提高了68%-75%。
本研究分离的乳酸菌菌株，尤其是A. kunkeei，具有作为蜜蜂美洲幼虫腐臭病生物防治剂的潜力，特别适用于感染早期的治疗，后续通过优化给药方案可进一步提高其防控效果。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C自动微生物生长曲线分析仪，在37℃恒温条件下，采用100孔蜂窝板培养体系，每小时自动测定一次600nm波长处的光密度（OD₆₀₀），连续监测18小时，获得了Paenibacillus larvae ATCC 9545 ERIC I孢子在6株乳酸菌72小时无细胞上清液处理下的完整生长动力学曲线，数据来自补充图4（Sup. 4）。其研究意义主要体现在以下五个方面：
动态定量评估杀孢子活性，突破传统方法局限：传统的平板菌落计数法只能获得某个时间点的终点数据，无法反映孢子从休眠到萌发、再到营养体增殖的连续过程。Bioscreen的实时连续监测技术可以完整记录这一动态过程，准确计算出孢子萌发延迟期、对数生长期比生长速率和最大生物量等关键动力学参数。例如，阴性对照组的孢子在培养6小时后完成萌发，进入快速对数生长期，12小时内OD₆₀₀从0.4上升至1.2；而除SYM-7外的所有乳酸菌上清液处理组，在18小时的监测期内OD₆₀₀始终维持在基线水平，没有出现任何生长迹象。这一结果直接且定量地证明了这些无细胞上清液具有强大的杀孢子活性，能够完全阻止P. larvae孢子的萌发，而不仅仅是抑制营养体的生长。
特异性检测孢子萌发，排除营养体干扰：实验中通过72℃水浴10分钟处理P. larvae培养物，严格杀死了所有营养体细胞，仅保留了具有耐热性的活孢子。因此，Bioscreen监测到的任何生长信号都只能来自于孢子的萌发和后续的营养体分裂。这种实验设计确保了杀孢子活性检测的特异性，避免了残留营养体对实验结果的干扰，使结论更加严谨可靠。
高通量高重复性，保障数据准确性：Bioscreen C仪器可同时测定100个样品的生长曲线，本研究每个处理设置了多个生物学重复，所有生长曲线的标准偏差均小于5%。自动化的检测过程完全避免了人工取样带来的操作误差和时间偏差，大大提高了实验效率和数据的可重复性。这种高通量特性也为后续筛选大量菌株或优化抗菌物质浓度提供了技术支撑。
为抗菌机制研究提供关键线索：生长曲线的特征可以为解析抗菌物质的作用机制提供重要方向。例如，SYM-7处理组出现了微弱的生长，说明其无细胞上清液的杀孢子活性较弱，只能部分抑制孢子萌发；而其他菌株的上清液能完全抑制生长，提示其产生的抗菌物质可能作用于孢子萌发的关键步骤（如孢子皮层的裂解、核心代谢的激活）或直接破坏孢子的结构。这些线索为后续分离纯化抗菌活性物质、解析其分子作用靶点指明了研究方向。
为产品开发提供定量依据：Bioscreen获得的定量数据可以用于标准化评估不同菌株无细胞上清液的抗菌效价，筛选出活性最强的菌株用于后续的产品开发。同时，通过测定不同稀释倍数上清液的生长曲线，可以准确计算出最小抑菌浓度（MIC）和最小杀孢子浓度（MBC），为蜂用益生菌产品的剂量优化、剂型开发和质量标准制定提供科学的量化依据。