INFLUENCE OF SIMULTANEOUS TREATMENT OF SEEDS WITH ZnONPs AND Bacillus subtilis ON THE BIOLOGICAL QUALITY PARAMETERS OF RED CABBAGE SEEDLINGS
同时用氧化锌纳米颗粒和枯草芽孢杆菌处理种子对红甘蓝幼苗生物质量参数的影响
来源：Acta Sci. Pol. Hortorum Cultus, 24(1) 2025, 33–49
1.摘要
为减少农用化学品对环境的负面影响，实现可持续粮食生产，开发新型绿色农业策略迫在眉睫。氧化锌纳米颗粒（ZnONPs）和植物根际促生菌（PGPR）枯草芽孢杆菌被证实具有促进植物生长的潜力，但两者联合使用的效果及相互作用机制尚不明确。本研究首先评估了0.2-1.4 mgcm³浓度范围内ZnONPs对枯草芽孢杆菌浮游生长、吲哚-3-乙酸（IAA）产生、生物膜形成、伊文思蓝降解能力及氧化应激水平的影响，筛选出对细菌毒性最低的0.2和0.4 mgcm³两个浓度用于后续种子处理实验。随后系统研究了单独接种枯草芽孢杆菌、单独使用ZnONPs以及两者联合处理对红甘蓝种子萌发、幼苗生理特性和矿质元素含量的影响。结果表明，与空白对照或单一处理相比，联合处理能显著提高种子萌发率、幼苗株高和根长，增加光合色素和抗氧化物质含量；同时使幼苗中锌和钠的积累量升高，而镁、钾、铁、锰、钴等元素含量低于或接近对照水平。综合各项指标，枯草芽孢杆菌+0.2 mg ZnONPs的组合效果最佳，能产生最高的种子萌发率、最长的植株和根系，以及最高的叶绿素、酚类化合物和抗氧化剂含量。研究证实低浓度ZnONPs能显著增强枯草芽孢杆菌作为植物促生菌的作用，为开发新型纳米-微生物复合种子处理剂提供了科学依据。
2.关键词（中文）
氧化锌纳米颗粒、植物根际促生菌、生理特性、种子萌发
3.研究目的
系统评估不同浓度ZnONPs对枯草芽孢杆菌生长、代谢活性和抗逆性的影响，明确其对该PGPR的毒性阈值和适宜作用浓度范围。
探究单独使用ZnONPs、单独接种枯草芽孢杆菌以及两者联合处理对红甘蓝种子萌发、幼苗生长、光合系统、抗氧化系统和矿质营养吸收的影响。
揭示ZnONPs与枯草芽孢杆菌之间的相互作用机制，验证低浓度ZnONPs是否能通过调控细菌生理代谢（如生物膜形成）增强其植物促生效果。
筛选出能协同促进红甘蓝幼苗生长的最佳ZnONPs浓度与枯草芽孢杆菌组合，为开发高效、环保的纳米-微生物复合生物肥料提供技术参数和理论支撑。
4.研究思路
采用“体外细菌毒性与功能评估-体内幼苗促生验证-协同机制分析”的递进式研究路线：首先在体外培养条件下，设置0.2-1.4 mgcm³的ZnONPs浓度梯度，测定其对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），并系统检测浮游生长、生物膜形成、IAA分泌、伊文思蓝降解能力和超氧阴离子产生量等关键生理指标，筛选出对细菌毒性最低且能保留其促生功能的0.2和0.4 mgcm³两个浓度。随后设置6个处理组（空白对照、单独枯草芽孢杆菌、单独0.2 mg ZnONPs、单独0.4 mg ZnONPs、枯草芽孢杆菌+0.2 mg ZnONPs、枯草芽孢杆菌+0.4 mg ZnONPs）进行红甘蓝种子浸种处理，在灭菌土壤中培养21天，动态监测种子萌发过程，收获后测定幼苗株高、根长、矿质元素含量、光合色素含量、总酚含量和总抗氧化能力（ABTS和DPPH双法）。最后综合分析体外和体内实验数据，比较不同处理组的差异，阐明ZnONPs与枯草芽孢杆菌协同促进红甘蓝幼苗生长的作用机制。
5.研究亮点
首次系统开展了ZnONPs与枯草芽孢杆菌联合处理对红甘蓝幼苗的影响研究，明确了两者的协同促生效应，发现低浓度ZnONPs能显著增强枯草芽孢杆菌的促生效果，为纳米农业与微生物农业的融合应用提供了新的范例。
突破了传统纳米材料抗菌研究的单一视角，全面评估了ZnONPs对枯草芽孢杆菌多方面生理功能的影响，不仅测定了生长抑制指标，还深入分析了与植物促生直接相关的生物膜形成、IAA分泌和有机污染物降解能力，为筛选适宜的应用浓度提供了全面的科学依据。
发现了ZnONPs对枯草芽孢杆菌生物膜形成的“低促高抑”双重效应：0.2-0.6 mgcm³的低浓度能显著促进生物膜形成（最高达对照的181.69%），而高浓度则会抑制生物膜生长，这一发现为理解纳米材料与有益微生物的相互作用提供了新的见解。
从矿质营养和抗氧化系统两个维度揭示了联合处理的优势，证明其不仅能通过锌生物强化提高红甘蓝的营养品质，还能显著增强幼苗的抗氧化能力和抗逆性，实现了产量与品质的同步提升。
严格控制实验条件，采用灭菌土壤排除了土著微生物的干扰，同时设置多个生物学重复和浓度梯度，保证了实验结果的可靠性和可重复性，为后续的田间应用奠定了坚实的基础。
6.可延伸的方向
分子机制解析：利用转录组、蛋白质组和代谢组技术，分析ZnONPs与枯草芽孢杆菌联合处理对红甘蓝幼苗基因表达、蛋白质合成和代谢通路的影响，从分子水平揭示其协同促生的深层机制。
田间试验验证：在不同土壤类型和气候条件下开展大田试验，评估纳米-微生物复合处理对红甘蓝产量、品质、病虫害抗性以及土壤微生物群落结构和功能的长期影响，验证其在实际农业生产中的应用效果。
纳米材料优化：研究不同粒径、表面电荷、晶型和表面修饰的ZnONPs与枯草芽孢杆菌的相互作用，筛选出生物相容性更好、促生效果更显著且环境风险更低的纳米材料。
复合菌剂开发：将ZnONPs与多种功能互补的PGPR菌株（如固氮菌、解磷菌、生防菌）复配，开发多功能复合生物肥料，提高其对不同作物和逆境条件的适应性。
环境风险评估：系统研究ZnONPs在土壤-植物-地下水系统中的迁移、转化、积累和降解规律，评估其长期使用对土壤生态系统、非靶标生物和人体健康的潜在风险。
抗逆性拓展：探究联合处理对红甘蓝在干旱、盐碱、重金属污染等逆境条件下的生长和抗逆性的影响，拓展其在逆境农业中的应用范围。
剂型开发：开发基于ZnONPs和枯草芽孢杆菌的种子包衣剂、缓释颗粒剂或叶面喷施剂，优化产品配方和生产工艺，提高其稳定性、货架期和使用便利性。
7.测量的数据及其研究意义
不同浓度ZnONPs处理下枯草芽孢杆菌的浮游生长OD值、生物膜形成率、IAA产生率、超氧阴离子产生量和伊文思蓝降解率数据，来自表1。意义：定量揭示了ZnONPs对枯草芽孢杆菌的浓度依赖性毒性，明确了其对细菌各项生理功能的影响规律，发现低浓度ZnONPs能促进生物膜形成这一关键促生相关特性，为筛选适宜的应用浓度提供了直接依据。
枯草芽孢杆菌对ZnONPs的最小抑菌浓度（MIC1.6 mgcm³）和最小杀菌浓度（MBC=1.8 mgcm³）数据，来自正文结果部分。意义：确定了ZnONPs对枯草芽孢杆菌的抑菌和杀菌阈值，证明该菌株对ZnONPs具有较高的耐受性，为其与ZnONPs的联合应用提供了安全性基础。
不同处理组在第5、7、9、12、14天的红甘蓝种子萌发率，以及21天幼苗的株高和根长数据，来自表2。意义：动态监测了种子萌发过程，定量比较了不同处理对红甘蓝早期生长的影响，证明联合处理的促生效果显著优于单一处理，且枯草芽孢杆菌+0.2 mg ZnONPs是最佳组合。
不同处理组红甘蓝幼苗中钠、钾、镁、铁、锰、铜、锌、钴8种矿质元素的含量数据，来自表3。意义：系统分析了ZnONPs和枯草芽孢杆菌对幼苗矿质营养吸收的调控作用，发现联合处理能显著提高锌的积累量，为通过农业手段进行锌生物强化、解决全球锌缺乏问题提供了新的途径。
不同处理组幼苗中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素的含量数据，来自表4。意义：证明联合处理能显著提高光合色素含量，尤其是叶绿素b，有利于增强植物的光合作用效率，为幼苗生长提供更多的物质和能量。
不同处理组幼苗的总酚含量、ABTS法和DPPH法测定的总抗氧化能力数据，来自表5。意义：从抗氧化系统的角度解释了联合处理的优势，证明其能提高幼苗的活性氧清除能力，增强其对环境胁迫的抵抗力，同时提升红甘蓝的营养保健价值。
8.结论
枯草芽孢杆菌对ZnONPs具有较高的耐受性，其MIC1.6 mgcm³，MBC=1.8 mgcm³。ZnONPs对枯草芽孢杆菌的影响具有明显的浓度依赖性：低浓度（0.2-0.6 mgcm³）能显著促进生物膜形成，而高浓度则会诱导氧化应激，抑制浮游生长、IAA分泌和伊文思蓝降解能力。
单独使用枯草芽孢杆菌或低浓度ZnONPs均能在一定程度上促进红甘蓝种子萌发和幼苗生长，但两者联合处理的效果更为显著。其中枯草芽孢杆菌+0.2 mg ZnONPs处理的种子14天萌发率高达98.67%，幼苗株高和根长分别比空白对照提高30%和22%。
联合处理能显著提高红甘蓝幼苗的光合色素含量，尤其是叶绿素b（比对照提高22%-33%），同时增加总酚含量和总抗氧化能力。枯草芽孢杆菌+0.2 mg ZnONPs处理的ABTS总抗氧化能力是对照的7.6倍，DPPH总抗氧化能力是对照的2.04倍。
联合处理会显著提高红甘蓝幼苗中锌和钠的含量，而镁、钾、铁、锰、钴等元素的含量则低于或接近对照水平，但仍能满足植物正常生长的需求。与单独使用ZnONPs相比，联合处理能缓解ZnONPs对部分矿质元素吸收的抑制作用。
低浓度ZnONPs与枯草芽孢杆菌的协同促生机制主要包括：ZnONPs促进枯草芽孢杆菌生物膜形成，增强其在植物根际的定殖能力；ZnONPs作为锌源补充植物营养，缓解锌缺乏；两者共同调控植物的抗氧化系统和矿质营养吸收，促进植物生长发育。
本研究结果表明，低浓度ZnONPs与枯草芽孢杆菌的联合使用是一种高效、环保的可持续农业策略，可减少化学肥料和农药的使用，提高作物产量和营养品质，具有广阔的应用前景。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线相关数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen仪器的微孔板培养体系，结合结晶紫染色分光光度法，测定了不同浓度ZnONPs处理48小时后枯草芽孢杆菌的生物膜形成量，数据来自表1。需要特别说明的是，本研究中Bioscreen仪器并非用于测定传统的浮游细菌生长曲线，而是利用其标准化的微孔板培养和光学检测系统，实现了生物膜形成量的高通量、精确定量。其研究意义主要体现在以下五个方面：
高通量标准化定量，提高实验可靠性：Bioscreen的96孔板体系可同时测定多个样品和浓度梯度，本研究设置了8个ZnONPs浓度和3个生物学重复，所有样品在完全相同的温度、湿度和振荡条件下培养，避免了传统培养皿法的环境差异和操作误差。通过测定结晶紫在600nm处的吸光度，将生物膜形成量转化为可量化的数值，实现了不同处理组之间的精确比较，大大提高了实验结果的重复性和可靠性。
揭示ZnONPs对生物膜形成的双重效应：传统研究多关注纳米材料的抗菌作用，认为其会抑制细菌生物膜形成。而本研究通过Bioscreen的精确测定发现，ZnONPs对枯草芽孢杆菌生物膜形成具有“低促高抑”的独特效应：0.2-0.6 mgcm³的低浓度能显著促进生物膜形成，其中0.4 mgcm³时生物膜量达到对照的181.69%；当浓度超过0.8 mgcm³时，生物膜形成量逐渐恢复到对照水平。这一发现修正了对纳米材料与微生物相互作用的片面认知，为理解低浓度纳米材料在农业环境中的生态效应提供了新的视角。
解释联合处理的核心促生机制：生物膜是PGPR在植物根际定殖的关键结构，它能保护细菌免受土壤中不利环境因素的影响，增强其与植物根系的相互作用，促进营养物质的传递和生长调节物质的分泌。本研究发现低浓度ZnONPs能显著促进枯草芽孢杆菌生物膜形成，这意味着在联合处理时，枯草芽孢杆菌能更有效地在红甘蓝根际定殖和繁殖，从而更好地发挥其溶解磷、分泌IAA、产生铁载体等促生功能。这一结果为解释ZnONPs与枯草芽孢杆菌的协同促生效应提供了最直接的机制依据。
为优化复合处理剂浓度提供关键参数：生物膜形成量是评估PGPR应用效果的核心指标之一。本研究通过Bioscreen系统测定，明确了促进枯草芽孢杆菌生物膜形成的最佳ZnONPs浓度范围为0.2-0.6 mgcm³，并据此选择了0.2和0.4 mgcm³两个浓度用于后续的红甘蓝种子处理实验。这一科学的浓度筛选过程保证了体内实验的针对性和有效性，避免了盲目设置浓度带来的资源浪费和结果偏差。
为纳米-微生物互作研究提供新方法：Bioscreen仪器的应用为研究纳米材料与微生物的相互作用提供了一种高效、标准化的技术手段。除了生物膜形成量，该系统还可用于测定浮游细菌生长曲线、细菌代谢活性、药物敏感性等多种指标，为全面评估纳米材料对有益微生物和病原微生物的影响提供了统一的技术平台，有利于不同研究之间的结果比较和数据共享。