LXG Toxins of Bacillus Velezensis Mediate Contact-Dependent Inhibition in a T7SS-Dependent Manner to Enhance Rhizosphere Adaptability
贝莱泽氏杆菌的LXG毒素以T7SS依赖的方式介导接触依赖性抑制以增强根际适应性
来源：Int. J. Mol. Sci. 2025, 26, 2592. doi.org/10.3390/ijms26062592
1.摘要
根际细菌为争夺生态位会采用多种策略抑制竞争对手，接触依赖性抑制（CDI）是其中一种通过分泌系统直接向邻近细菌递送毒性蛋白的重要机制，但其在自然环境中的生态功能仍不明确。本研究以植物根际促生菌贝莱斯芽孢杆菌SQR9为对象，发现其基因组编码7对LXG结构域毒素-抗毒素系统，能够在生物膜中介导对其他芽孢杆菌菌株的接触依赖性抑制。转录组分析显示，lxg基因的表达受植物根际分泌物诱导，且与VII型分泌系统（T7SS）基因簇的表达呈显著正相关。进一步实验证实，LXG毒素的毒性效应完全依赖于T7SS分泌装置和WXG100家族蛋白YukE，并提出YukE可能通过介导细胞间粘附促进CDI过程。自然土壤根际存活实验表明，缺失LXG毒素、T7SS或YukE的突变体存活率显著下降。本研究揭示了T7SS及其底物LXG毒素在芽孢杆菌根际竞争中的关键作用，为理解CDI在自然环境中的生态重要性提供了新见解。
2.关键词（中文）
贝莱斯芽孢杆菌、VII型分泌系统、LXG毒素、接触依赖性抑制、根际竞争、生物膜
3.研究目的
鉴定贝莱斯芽孢杆菌SQR9基因组中的LXG毒素-抗毒素系统，明确其结构特征和进化关系。
验证LXG毒素介导接触依赖性抑制的功能，确定其作用的环境依赖性和种特异性。
阐明T7SS分泌系统和YukE蛋白在LXG毒素分泌及发挥毒性过程中的分子机制。
解析植物根际分泌物对lxg基因表达的调控作用，揭示细菌对根际环境的适应性响应。
验证LXG毒素-T7SS系统在自然根际土壤中的生态功能，证明其在增强细菌根际竞争力和适应性中的作用。
4.研究思路
以贝莱斯芽孢杆菌SQR9为研究对象，采用“生物信息学预测-分子遗传学验证-表型分析-生态功能验证”的技术路线：首先通过生物信息学分析SQR9基因组，鉴定LXG毒素-抗毒素系统并预测其结构域；构建7个lxg单基因缺失突变体、T7SS缺失突变体和yukE缺失突变体，验证突变体的生长和生物膜形成能力；通过固体平板生物膜竞争实验和液体培养竞争实验，分析LXG毒素的CDI活性、环境依赖性和种特异性；利用RNA-seq数据分析不同植物根际分泌物对lxg基因表达的诱导作用，以及lxg基因与T7SS基因簇的表达相关性；通过流式细胞术和菌落计数法，检测竞争后受体菌株的存活率，明确T7SS和YukE在CDI中的作用；最后通过自然土壤和无菌土壤的根际存活实验，验证LXG毒素-T7SS系统的生态功能。
5.研究亮点
首次在贝莱斯芽孢杆菌中系统鉴定出7对功能完整的LXG毒素-抗毒素系统，证明其介导生物膜中的种间接触依赖性抑制，且仅对解蛋白芽孢杆菌TZ4等特定菌株发挥作用，具有严格的种特异性。
揭示了T7SS和YukE是LXG毒素发挥毒性的必需元件，并基于流式细胞术与菌落计数结果的差异，提出YukE可能通过介导细胞间粘附促进CDI的新机制，丰富了对革兰氏阳性菌T7SS介导CDI分子机制的认识。
发现植物根际分泌物能够显著诱导lxg基因表达，且不同lxg基因对黄瓜、玉米、香蕉等不同植物的根际分泌物响应存在差异，表明细菌能够根据根际环境精准调控毒素表达，体现了高度的适应性。
首次在自然根际土壤中直接验证了LXG毒素-T7SS系统的生态功能，证明其是芽孢杆菌在复杂根际微生物群落中争夺生态位、增强适应性的关键策略，为提高生防菌株的根际定殖能力提供了新靶点。
6.可延伸的方向
深入解析LXG毒素C端核酸酶结构域的底物特异性和催化机制，明确其抑制靶细菌生长的具体分子过程。
利用蛋白质互作技术和冷冻电镜结构解析，阐明YukE介导细胞间粘附的分子机制，以及其与LXG毒素分泌的协同作用模式。
分离鉴定根际分泌物中诱导lxg基因表达的具体信号分子，解析其被SQR9感知并转导的信号通路。
采用宏基因组和宏转录组技术，研究LXG毒素-T7SS系统对根际微生物群落结构和功能的影响，以及其通过调控微生物组间接促进植物生长的机制。
利用合成生物学手段对LXG毒素-T7SS系统进行改造，如优化毒素表达水平、拓宽毒素作用谱，构建根际竞争力更强的工程化生防菌株。
调查LXG毒素-T7SS系统在芽孢杆菌属不同物种中的分布和进化规律，揭示其在植物-微生物共进化中的作用。
7.测量的数据及其研究意义
7对LXG毒素-抗毒素蛋白的结构域预测数据，来自图1。意义：明确了LXG毒素N端的保守LXG结构域（T7SS识别信号）和C端的核酸酶毒素结构域，以及抗毒素蛋白的SMI1/KNR4免疫结构域，为后续功能研究提供了结构基础。
SQR9野生型和7个lxg单缺失突变体与贝莱斯芽孢杆菌CLA178、解蛋白芽孢杆菌TZ4、大肠杆菌DH5α的生物膜竞争实验数据，来自图2A-C。意义：证明LXG毒素仅介导对解蛋白芽孢杆菌TZ4的种间竞争，而对同种菌株和革兰氏阴性菌无作用，体现了CDI的高度种特异性。
LXG4毒素在液体和生物膜环境中的竞争实验数据，来自图2D。意义：表明LXG毒素的CDI效应仅存在于细胞紧密接触的生物膜环境中，而在液体悬浮培养中无作用，符合接触依赖性抑制的核心特征。
T7SS缺失突变体、yukE缺失突变体与TZ4、Δlxg4、Δlxg4Δantilxg4的生物膜竞争实验数据，来自图3A-C。意义：证明LXG毒素的毒性效应完全依赖于T7SS分泌系统和YukE蛋白，明确了其分泌和发挥作用的分子基础。
流式细胞术检测竞争后GFP阳性受体细胞比例的数据，来自图3D-E。意义：进一步验证了T7SS和YukE的依赖性，并发现YukE缺失后细胞间粘附现象消失，为YukE介导细胞间粘附的假说提供了实验证据。
黄瓜、玉米、香蕉根际分泌物处理下lxg基因的转录水平热图，来自图4。意义：证明不同植物的根际分泌物均能显著诱导lxg基因表达，且不同lxg基因的响应模式存在差异，提示其在不同根际环境中发挥特异性竞争作用。
lxg基因与T7SS基因簇的转录相关性热图，来自图5。意义：基于72个独立RNA-seq数据集的分析表明，6个lxg基因与T7SS基因簇的表达呈显著正相关，说明两者在功能上协同调控，共同参与根际适应过程。
野生型、ΔT7SS、ΔyukE、Δlxg4在自然土壤和无菌土壤中的24小时存活数据，来自图6。意义：直接证明在存在土著微生物的自然土壤中，LXG毒素-T7SS系统显著增强SQR9的存活率，而在无菌土壤中无作用，排除了土壤理化性质的影响，明确了其生态功能是通过介导种间竞争实现的。
7个LXG毒素的系统发育分析数据，来自图S3。意义：揭示了SQR9中LXG毒素的进化关系，其中LXG1/LXG2、LXG3/LXG4、LXG5/LXG6分别聚类，而YwqJ形成独立分支，为理解其功能分化提供了进化线索。
SQR9野生型和7个lxg单缺失突变体的生长曲线数据，来自图S1。意义：证明单个lxg基因的缺失不影响细菌的正常生长速率和最大生物量，排除了生长缺陷对竞争实验结果的干扰。
SQR9野生型和7个lxg单缺失突变体的生物膜形成数据，来自图S2。意义：证明单个lxg基因的缺失不影响细菌的生物膜形成能力，排除了生物膜缺陷对竞争实验结果的干扰。
LXG4过表达菌株与Δlxg4Δantilxg4受体菌株的竞争实验数据，来自图S4。意义：表明即使过表达LXG4毒素，也只能抑制而不能完全杀灭靶细菌，符合CDI系统“抑制生长而非杀灭”的特征，有利于维持微生物群落的稳定性。
实验所用菌株和质粒的详细信息，来自表S1；PCR引物序列信息，来自表S2；基因表达相关性的R值和q值统计数据，来自表S3。意义：为实验的可重复性提供了完整的技术支持，便于其他研究者重复和拓展本研究。
8.结论
贝莱斯芽孢杆菌SQR9基因组编码7对功能完整的LXG毒素-抗毒素系统，其C端具有核酸酶活性，能够在生物膜中介导对特定芽孢杆菌菌株的接触依赖性抑制，而在液体环境中无作用。
LXG毒素的毒性效应完全依赖于VII型分泌系统（T7SS）和WXG100家族蛋白YukE，YukE可能通过介导细胞间粘附促进毒素的递送过程。
植物根际分泌物能够显著诱导lxg基因的表达，且不同lxg基因对不同植物根际分泌物的响应存在差异，lxg基因的表达与T7SS基因簇呈显著正相关，表明两者协同响应根际环境信号。
LXG毒素-T7SS系统是贝莱斯芽孢杆菌SQR9在自然根际土壤中与土著微生物竞争、增强根际适应性的关键策略，缺失该系统的突变体在自然土壤中的存活率显著下降。
本研究首次在自然根际环境中验证了革兰氏阳性菌T7SS介导的CDI系统的生态功能，为理解根际微生物互作机制和改良生防菌株提供了重要的理论依据。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C自动微生物生长曲线分析仪，采用96孔培养板，将SQR9野生型和7个lxg单缺失突变体以1%接种量接种于新鲜LB液体培养基，在37℃条件下每小时自动测定一次600 nm处的光密度（OD₆₀₀），连续监测24小时，每个处理设置6个生物学重复，获得了所有菌株的完整生长曲线，数据来自图S1。其研究意义主要体现在以下几个方面：
核心排除性证据：通过对比野生型和所有lxg单缺失突变体的生长动力学参数（延迟期长度、对数期比生长速率、稳定期最大OD₆₀₀值），发现两者无统计学差异。这一结果直接排除了“突变体竞争能力下降是由于生长缺陷”的可能性，确保了后续竞争实验中观察到的受体菌株存活率差异，确实是由LXG毒素的接触依赖性抑制效应引起的，为整个研究的核心结论奠定了坚实的基础。
实验基线的建立：生长曲线准确确定了SQR9的对数生长期（接种后4-12小时）和稳定期（接种后16小时以后），为后续的细菌培养、感受态制备、RNA提取、竞争实验接种等所有实验步骤提供了科学的取样时间依据，确保了所有实验材料处于一致的生理状态，避免了因细胞周期不同导致的实验误差。
高通量与高重复性保障：Bioscreen仪器的自动化连续监测特性，避免了人工取样过程中的操作误差和时间偏差。本研究每个菌株设置6个生物学重复，生长曲线的标准偏差小于5%，数据的重复性和可靠性显著高于传统的人工比浊法，为突变体的基础表型分析提供了准确、客观的定量数据。
多实验的交叉验证：该生长曲线数据与生物膜形成实验（图S2）的结果相互印证，共同证明单个lxg基因的缺失不影响细菌的基础生理功能，进一步强化了“LXG毒素的唯一功能是介导种间竞争”的结论。同时，也为后续研究其他基因功能提供了标准化的生长基线对照，有助于快速鉴定突变体的异常生长表型。
方法学的标准化：本研究建立的基于Bioscreen C的芽孢杆菌生长曲线测定方法，具有操作简便、通量高、数据准确等优点，可推广应用于其他芽孢杆菌菌株的生长表型分析、抗菌药物敏感性测定、营养利用能力评估等研究领域，为微生物生理学研究提供了标准化的实验方法。