Advanced Spectroscopic and Theoretical Study and Assessment of Antimycotic Potential in a Synergistic Composition of a 1,3,4-Thiadiazole Derivative and Amphotericin B
1,3,4-噻二唑衍生物与两性霉素B协同组合物抗真菌潜力的高级光谱学与理论研究及评估
来源：ACS Omega 2025, 10, 21173−21186
1.摘要
本研究对新型1,3,4-噻二唑衍生物2,4-二羟基-N-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)苯并硫代酰胺（TBTA）与抗真菌“金标准”两性霉素B（AmB）的协同组合物进行了系统的光谱学、量子化学理论计算和微生物学研究。通过电子吸收/荧光光谱、共振光散射（RLS）、圆二色谱（CD）、动态光散射（DLS）、荧光各向异性及时间相关单光子计数（TCSPC）荧光寿命测定等多种技术，在DMSO和PBS介质中分析了TBTA对AmB聚集状态的影响。结果表明，TBTA可与AmB分子发生特异性相互作用，显著促进水溶液中AmB聚集体的解聚。量子化学计算进一步揭示，TBTA优先结合AmB的疏水区域（多烯链和大环结构），通过氢键和π-π堆积作用稳定复合物，阻断AmB分子间的聚集位点。微生物学实验以酿酒酵母为模型，证实TBTA与AmB具有显著协同抗真菌活性，最优组合可使AmB的有效抑制浓度降低4倍。本研究首次阐明了TBTA与AmB协同作用的分子机制，为开发低毒、高效的新型抗真菌药物组合物提供了重要的理论和实验依据。
2.关键词（中文）
1,3,4-噻二唑衍生物、两性霉素B、协同效应、解聚作用、抗真菌活性、分子光谱学、量子化学计算
3.研究目的
揭示新型1,3,4-噻二唑衍生物TBTA与两性霉素B（AmB）协同抗真菌作用的分子机制，明确TBTA对AmB聚集状态的调控规律。
从分子水平解析TBTA与AmB的相互作用模式和结合位点，为理解1,3,4-噻二唑类化合物与多烯抗生素的通用协同机制提供理论基础。
定量评估TBTA/AmB组合物对酿酒酵母的抗真菌活性，确定最佳协同配比，验证其降低AmB有效剂量的潜力。
建立光谱学与理论计算相结合的药物-药物相互作用研究体系，为新型抗真菌协同剂的筛选和设计提供方法学参考。
4.研究思路
以TBTA和AmB为研究对象，构建“光谱表征-理论计算-生物活性验证”的一体化研究体系：首先合成TBTA化合物，制备不同摩尔比的TBTA/AmB混合体系，分别在DMSO（模拟单体环境）和PBS（模拟生理聚集环境）中，通过电子吸收光谱、荧光发射/激发光谱初步分析分子间相互作用；进一步利用CD、RLS、DLS、荧光各向异性和TCSPC荧光寿命测定等技术，从构象、聚集体尺寸、分子运动性和激发态动力学等多个维度，系统表征TBTA对AmB聚集状态的影响；采用GFN2-xTB半经验量子化学方法结合GBSA隐式溶剂模型，通过伪穷尽构象搜索计算TBTA与AmB的稳定结合模式和结合能，从原子水平揭示相互作用机制；最后采用CLSI M27-A2微量稀释法，利用Bioscreen C自动微生物生长分析仪动态监测酿酒酵母的生长曲线，测定单独及联合用药的最低抑菌浓度（MIC），计算部分抑制浓度指数（FIC）定量评估协同效应。
5.研究亮点
首次系统阐明了TBTA与AmB的协同分子机制：发现TBTA通过特异性结合AmB的疏水聚集位点，有效破坏AmB分子间的疏水相互作用，促进水溶液中AmB聚集体解聚为单体或低聚体，这是其协同抗真菌活性的核心原因。
多维度光谱技术与理论计算的深度融合：综合运用7种光谱学技术和量子化学计算，从宏观光谱特征到微观分子结构，全面解析了TBTA/AmB体系的相互作用，避免了单一方法的局限性，结论更具说服力。
显著降低AmB的有效剂量：最优协同组合（0.25 μg/mL AmB + 16 μg/mL TBTA）可使AmB的MIC从1 μg/mL降低至原来的1/4，同时TBTA单独的MIC高达128 μg/mL，大幅降低了AmB的肾毒性风险。
发现1,3,4-噻二唑类化合物的通用协同模式：TBTA与AmB的结合位点和作用方式与本团队之前研究的C1衍生物高度相似，提示该类化合物通过“疏水结合+氢键”的通用机制促进AmB解聚，为系列衍生物的结构优化提供了明确方向。
直观的可视化验证：通过365 nm紫外光激发下的样品照片（图6），直观展示了TBTA加入后AmB溶液光散射特性的变化，与光谱数据形成完美印证。
6.可延伸的方向
拓展抗真菌谱：测试TBTA/AmB组合物对临床常见致病真菌（如白色念珠菌、烟曲霉、新生隐球菌）及耐药菌株的活性，评估其广谱抗真菌潜力。
开展体内药效和安全性评价：建立小鼠系统性真菌感染模型，研究组合物的体内抗真菌效果、组织分布和急性/亚急性毒性，为临床前研究奠定基础。
结构优化与衍生物筛选：基于TBTA与AmB的结合模式，对TBTA的苯环和噻二唑环进行结构修饰，合成系列衍生物，筛选结合力更强、协同活性更高的化合物。
制剂开发：将TBTA/AmB组合物制备成脂质体、纳米粒或胶束制剂，进一步提高其水溶性、稳定性和靶向性，降低全身毒性。
联合用药拓展：研究TBTA与其他抗真菌药物（如氟康唑、伊曲康唑、卡泊芬净）的协同效应，探索多药联合治疗耐药真菌感染的新方案。
分子机制深化：利用分子动力学模拟和固态NMR技术，研究TBTA/AmB复合物在真菌细胞膜（含麦角固醇）和人细胞膜（含胆固醇）中的行为差异，阐明其选择性抗真菌的分子基础。
7.测量的数据及其研究意义
DMSO和PBS介质中TBTA、AmB及不同比例组合物的电子吸收光谱数据，来自图1。意义：在DMSO中AmB以单体为主，吸收光谱无明显变化；在PBS中，TBTA加入后AmB单体特征峰（408 nm）增强，聚集体特征峰（335 nm）相对减弱，初步证明TBTA促进AmB解聚。
PBS介质中TBTA、AmB及组合物的荧光发射光谱数据，来自图2。意义：AmB二聚体特征发射峰（478 nm）强度随TBTA浓度增加而降低，同时TBTA自身荧光增强，表明AmB二聚体解离，能量转移或荧光共振能量转移过程发生改变。
PBS介质中AmB及组合物的荧光各向异性曲线数据，来自图3。意义：组合物的荧光各向异性从AmB单独的~0.08降至~0.035，说明分子旋转运动性增加，聚集体解体为更小的单元。
PBS介质中TBTA、AmB及不同比例组合物的圆二色谱（CD）数据，来自图4。意义：AmB的特征Cotton效应（325 nm正峰、350 nm负峰）强度随TBTA浓度增加而显著减弱，直接证明AmB分子的手性聚集环境被破坏，解聚为单体。
DMSO和PBS介质中TBTA、AmB及组合物的共振光散射（RLS）光谱数据，来自图5。意义：RLS信号强度与聚集体大小呈正相关，TBTA加入后250-430 nm区域的RLS强度显著降低，证实AmB大聚集体解体。
365 nm紫外光激发下TBTA、AmB及组合物的样品照片数据，来自图6。意义：直观显示AmB溶液呈明显乳光（大聚集体散射），而组合物溶液乳光减弱，与RLS光谱结果一致。
DMSO和PBS介质中AmB及组合物的荧光寿命衰减曲线数据，来自图7；对应的荧光寿命组分及平均寿命数据，来自表1。意义：PBS中AmB的平均荧光寿命为1.61 ns，加入TBTA后延长至2.04 ns，且短寿命组分（对应聚集体）的占比从68.5%降至11.1%，长寿命组分（对应单体）占比显著增加，从分子动力学角度证实解聚过程。
PBS和DMSO介质中TBTA、AmB及组合物的平均水动力粒径和多分散指数（PDI）数据，来自图8和表2。意义：AmB在PBS中的平均粒径为874 nm，加入TBTA后降至550 nm，PDI略有降低，直接证明聚集体尺寸减小，分布更均匀。
TBTA与AmB二聚体的结合能计算数据及最稳定结合模式的结构示意图，来自图9。意义：计算得到两种最稳定的“头对头”结合模式，结合能分别为-14.8和-15.2 kcal/mol，揭示TBTA通过氢键和π-π堆积作用结合AmB的疏水区域，阻断分子间聚集位点。
不同浓度TBTA、AmB及组合物作用下酿酒酵母的生长曲线数据，来自图10。意义：动态监测48小时内真菌的生长过程，直观显示单独用药（TBTA 64 μg/mL、AmB 0.5/0.25/0.125 μg/mL）均不能完全抑制生长，而相应组合可完全抑制，证实协同效应。
不同TBTA/AmB组合的部分抑制浓度指数（ΣFIC）数据，来自表3。意义：定量评估协同效应，其中0.25 μg/mL AmB + 16 μg/mL TBTA组合的ΣFIC=0.375（≤0.5），为强协同作用；另外两种组合为相加作用，明确了最佳协同配比。
8.结论
光谱学研究一致证实，TBTA可显著促进水溶液中AmB聚集体的解聚：电子吸收、荧光、CD、RLS和DLS数据均显示，TBTA加入后AmB的聚集特征减弱，单体特征增强，聚集体尺寸从874 nm减小至550 nm。
量子化学计算揭示了分子相互作用机制：TBTA优先以“头对头”方式结合AmB的疏水区域，通过与AmB的大环氧原子形成氢键，以及噻二唑环与AmB多烯链的π-π堆积作用稳定复合物，阻断AmB分子间的聚集位点。
微生物学实验验证了显著的协同抗真菌活性：TBTA单独抗真菌活性较弱（MIC=128 μg/mL），但与AmB联合使用时，可使AmB的MIC降低4倍（从1 μg/mL降至0.25 μg/mL），最优组合的ΣFIC=0.375，表现为强协同效应。
TBTA的协同作用具有通用性：其与AmB的结合模式与本团队之前研究的C1衍生物高度相似，提示1,3,4-噻二唑母核结构是促进AmB解聚的关键药效团。
本研究为开发低毒高效的抗真菌药物提供了新策略：通过TBTA促进AmB解聚，可在保持抗真菌活性的前提下大幅降低AmB的使用剂量，从而减轻其剂量依赖性肾毒性，具有重要的临床应用价值。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C自动微生物生长分析仪，采用96孔微量培养板，在28℃条件下每2小时自动测定一次600 nm处的光密度（OD₆₀₀），连续监测48小时，获得了酿酒酵母在RPMI-1640培养基中，分别在空白对照、不同浓度TBTA单独、不同浓度AmB单独及不同比例TBTA/AmB组合物作用下的完整生长曲线，数据来自图10。其研究意义主要体现在以下几个方面：
动态、定量评估抗真菌活性：传统的终点法MIC测定仅能获得48小时的最终结果，无法反映真菌生长的动态过程。Bioscreen的连续监测可以完整记录真菌的延迟期、对数生长期和稳定期，准确计算最大比生长速率、延迟期时长和倍增时间等关键生长参数。例如，单独使用64 μg/mL TBTA时，酿酒酵母的倍增时间从21.1小时延长至35.9小时，延迟期显著增加，说明TBTA本身虽不能完全抑制生长，但能显著减缓真菌增殖，这为其与AmB的协同作用奠定了基础。
直观验证协同效应：通过对比单独用药和联合用药的生长曲线，可以直观地观察到协同作用。如图10所示，单独使用0.5 μg/mL AmB时，真菌仍能缓慢生长（OD₆₀₀最终达到~0.8），而加入8 μg/mL TBTA后，生长被完全抑制（OD₆₀₀始终接近0）；单独使用0.25 μg/mL AmB时，真菌生长几乎不受影响，而加入16 μg/mL TBTA后，生长被完全抑制。这种动态对比比终点法更具说服力，能够清晰展示两种药物的协同增效作用。
高通量筛选最佳协同配比：Bioscreen仪器可同时测定96个样品的生长曲线，本研究采用棋盘法设计了9个TBTA浓度和8个AmB浓度的组合，共72个实验组，通过一次实验即可完成所有组合的活性筛选，大大提高了实验效率。通过分析所有组合的生长曲线，最终确定了0.25 μg/mL AmB + 16 μg/mL TBTA为最佳协同配比，为后续的体内实验和制剂开发提供了准确的剂量参考。
保证实验的高重复性和客观性：仪器的自动化操作避免了人工取样带来的误差，每个实验组设置3个生物学重复，生长曲线的标准偏差小于5%，数据的重复性和可靠性显著提高。同时，OD值的自动记录和存储避免了人为读数的主观偏差，保证了实验结果的客观性。
为机制研究提供补充证据：生长曲线数据显示，TBTA主要延长真菌的延迟期，而AmB主要抑制对数生长期的增殖，两者的作用机制不同，这解释了为什么它们能够产生协同效应。TBTA通过减缓真菌生长，为AmB发挥杀菌作用争取了时间，同时AmB的杀菌作用又阻止了真菌对TBTA产生适应性，两者相互配合，实现了更强的抗真菌效果。
建立标准化的抗真菌活性测定方法：本研究建立的基于Bioscreen C的酿酒酵母抗真菌活性测定方法，具有操作简便、通量高、数据准确、可动态监测等优点，可推广应用于其他抗真菌药物的筛选和活性评价，为抗真菌药物的研发提供了标准化的实验平台。