Organic fertilizer enhances the secretion of microRNAs from tomato roots to facilitate beneficial rhizosphere microorganism expansion and suppress Ralstonia solanacearum proliferation
有机肥增强番茄根部微小RNA的分泌以促进有益根际微生物扩张并抑制青枯雷尔氏菌增殖
来源：Liu et al. Microbiome (2025) 13:159
1.摘要
抑病土壤的根际微生物组、植物根系分泌物及病原菌抑制是植物根际免疫的核心要素，“呼救”机制被用于描述这一免疫响应过程，但目前对植物调控根际微生物功能基因的机制仍存在认知空白，多数研究仅证实根系分泌物介导了“呼救”过程。真核生物与原核生物通过微小RNA（miRNA）的跨界互作为宿主-微生物互作研究提供了新方向。本研究通过连续六代番茄盆栽实验，发现有机肥（OF）和等养分化肥（CF）处理均能形成青枯病抑病土壤，且有机肥的抑病效果显著优于化肥。研究首次证实番茄根系可通过类外泌体胞外囊泡分泌miRNA到根际土壤，其中sly-miR159和sly-miR319c-3p是核心功能分子：sly-miR159既能抑制青枯雷尔氏菌增殖，又能促进链霉菌属和芽孢杆菌属有益菌的生长；sly-miR319c-3p特异性抑制青枯雷尔氏菌生长。进一步解析发现，有机肥的活性组分包括可溶性大分子非微生物组分和微生物组分：非微生物组分诱导番茄根系分泌关键miRNA，微生物组分则为根际提供初始有益微生物群落，两者协同作用增强根际抑病能力。本研究揭示了植物根系分泌miRNA作为跨界信号分子调控根际免疫的新机制，为理解植物-根际微生物互作提供了全新视角。
2.关键词（中文）
微小RNA、有机肥、青枯雷尔氏菌、根际微生物组、番茄
3.研究目的
验证番茄根系是否能分泌miRNA到根际土壤，并明确其转运载体。
分析根际miRNA丰度与番茄青枯病指数的相关性，筛选与病害防控相关的核心miRNA。
明确核心miRNA对青枯雷尔氏菌及关键有益根际微生物生长的调控作用。
拆分有机肥的功能组分，解析其诱导根系miRNA分泌和增强根际抑病能力的机制。
揭示有机肥通过miRNA介导的植物-根际微生物互作新途径，完善植物根际免疫的“呼救”理论。
4.研究思路
采用“长期盆栽定位-多组学关联-体外功能验证-组分机制解析”的一体化研究路线：首先设置有机肥和等养分化肥两个处理组，连续六代种植番茄，动态监测青枯病发生情况和根际病原菌丰度，明确抑病土壤的形成过程；其次通过透射电镜观察根际类外泌体囊泡，结合qPCR定量根际miRNA丰度，筛选差异表达的番茄miRNA；利用16S rRNA扩增子测序分析根际微生物群落结构，通过相关性分析关联miRNA、微生物丰度与病害指数，锁定核心miRNA和关键有益菌属；分离纯化根际优势有益菌（枯草芽孢杆菌、弗氏链霉菌），采用芬兰Bioscreen自动生长曲线仪验证核心miRNA对病原菌和有益菌生长的调控作用；最后将有机肥拆分为完整组分、可溶性组分、微生物组分和非微生物组分，对比分析各组分对病害指数、miRNA分泌和有益菌丰度的影响，整合提出有机肥调控根际免疫的双重作用机制。
5.研究亮点
首次在根际土壤中检测到番茄分泌的miRNA，并证实类外泌体胞外囊泡是其主要转运载体，突破了传统“根系分泌物仅为小分子代谢物”的认知，拓展了植物-微生物跨界信号交流的分子类型。
鉴定出具有双向调控功能的核心miRNA：sly-miR159同时发挥“抑病促益”作用，既抑制青枯雷尔氏菌增殖，又特异性促进芽孢杆菌和链霉菌的生长；sly-miR319c-3p则特异性靶向病原菌，为精准调控根际微生物组提供了新型分子工具。
解析了有机肥的双重协同作用机制：非微生物组分（可溶性大分子）诱导植物根系分泌关键miRNA，微生物组分提供初始有益菌库，两者协同实现“信号诱导+菌群补充”，从根本上解释了有机肥比化肥更能有效防控土传病害的原因。
建立了“植物-miRNA-根际微生物”的互作研究体系，首次将miRNA介导的跨界调控纳入植物根际免疫框架，丰富了“呼救”机制的科学内涵，为土传病害的绿色防控提供了全新的理论基础和技术方向。
6.可延伸的方向
分子机制深化：利用转录组、降解组测序技术，鉴定sly-miR159和sly-miR319c-3p在青枯雷尔氏菌、枯草芽孢杆菌和弗氏链霉菌中的靶基因，解析miRNA调控原核生物基因表达的具体分子机制。
活性物质鉴定：分离纯化有机肥非微生物组分中的活性物质（如腐殖酸、多糖、多肽等），明确其被番茄根系感知并诱导miRNA分泌的信号转导通路。
广谱性验证：研究不同作物（如黄瓜、辣椒、烟草）根系分泌miRNA的种类和功能，以及其对镰刀菌、疫霉菌等其他土传病原菌的调控作用，验证该机制的普遍性。
应用技术开发：开发基于miRNA的生物农药或微生物菌剂增效剂，通过外源喷施miRNA或改造有益菌使其对植物miRNA更敏感，提高土传病害的防控效果。
田间应用研究：评估田间条件下miRNA的稳定性、迁移规律及对根际微生物群落的长期影响，优化有机肥与miRNA的配施方案，建立绿色防控技术体系。
进化生态学研究：比较野生型和栽培型番茄根系分泌miRNA的差异，探究植物-微生物通过miRNA互作的共进化规律，为作物抗病育种提供新的靶点。
7.测量的数据及其研究意义
第1代和第6代番茄青枯病指数数据，来自图1A；第6代有机肥和化肥处理组的番茄病指对比数据，来自图1B。意义：证明连续六代种植后两组均形成抑病土壤，且有机肥的抑病效果显著优于化肥，为后续机制研究提供了核心表型依据。
第6代番茄植株地上部和根际土壤中青枯雷尔氏菌的绝对丰度数据，来自图1C、图1D。意义：定量验证有机肥处理能显著降低病原菌在植株内和根际的定殖量，与病指结果形成相互印证。
有机肥和化肥处理组根际土壤中类外泌体胞外囊泡的透射电镜观察结果，来自图2A、图2B。意义：直观证实根际土壤中存在典型的杯状类外泌体囊泡，为miRNA的胞外转运提供了直接的载体证据。
第6代根际土壤中6种番茄抗病相关miRNA的相对丰度数据，来自图2C。意义：证明番茄miRNA可稳定存在于根际土壤，且有机肥处理显著提高了所有检测miRNA的丰度，其中sly-miR159上调幅度达26.68倍，为核心miRNA筛选提供了数据支持。
第6代根际微生物群落的α多样性（Chao1指数）数据，来自图3A；β多样性（PCA分析）数据，来自图3B。意义：表明有机肥处理显著提高了根际微生物群落的丰富度和多样性，改变了群落整体结构，为有益菌的富集创造了条件。
根际前30属微生物与青枯病指数、病原菌丰度的相关性热图，来自图3C。意义：筛选出链霉菌、芽孢杆菌等6个与病指和病原菌丰度均呈显著负相关的有益菌属，明确了根际抑病的关键微生物类群。
6种miRNA与番茄青枯病指数的相关性分析数据，来自图4A。意义：鉴定出sly-miR159、sly-miR319c-3p、sly-miR166与病指呈显著负相关，确定了后续功能验证的核心候选miRNA。
6种miRNA与根际前30属微生物的相关性热图，来自图4B。意义：发现sly-miR159与链霉菌、芽孢杆菌的丰度呈显著正相关，提示其对有益菌具有潜在的调控作用。
根际分离的芽孢杆菌和链霉菌的物种组成比例数据，来自图5A。意义：明确枯草芽孢杆菌和弗氏链霉菌是根际的优势有益菌种，为后续miRNA功能验证提供了实验材料。
sly-miR319c-3p、sly-miR159、miRNA阴性对照（NC）、sly-miR166对青枯雷尔氏菌生长的影响数据，来自图5B-E。意义：证明sly-miR159和sly-miR319c-3p能显著抑制青枯菌生长，而sly-miR166无作用，排除了非特异性效应。
sly-miR159和miRNA NC对枯草芽孢杆菌、弗氏链霉菌生长的影响数据，来自图5F-I。意义：证实sly-miR159能显著促进两种有益菌的生长，明确了其“抑病促益”的双向调控功能。
不同有机肥组分处理下第1-5代番茄青枯病指数数据，来自图6A。意义：表明完整有机肥和可溶性组分的抑病效果最佳，单一微生物组分或非微生物组分效果有限，揭示了有机肥各组分的协同作用。
不同有机肥组分处理下第1-5代根际土壤中青枯雷尔氏菌的绝对丰度数据，来自图6B。意义：定量验证不同组分对病原菌的抑制效果，与病指变化趋势完全一致，进一步支持了组分协同的结论。
不同有机肥组分处理下第2代和第5代根际土壤中3种核心miRNA的相对丰度数据，来自图7A。意义：证明有机肥的非微生物组分是诱导番茄根系分泌miRNA的关键活性部分。
不同有机肥组分处理下根际土壤中枯草芽孢杆菌和弗氏链霉菌的绝对丰度数据，来自图7B。意义：表明有机肥的微生物组分是根际有益菌的主要初始来源，与miRNA协同促进有益菌的定殖和扩张。
有机肥调控番茄根际免疫的机制示意图，来自图7C。意义：直观总结了“非微生物组分诱导miRNA分泌+微生物组分提供有益菌”的双重作用机制，清晰呈现了整个研究的核心逻辑。
不同有机肥组分处理下根际类外泌体囊泡的透射电镜观察结果，来自图S1。意义：补充验证所有处理组的根际土壤中均存在类外泌体囊泡，排除了载体差异对miRNA丰度的影响。
第1代有机肥和化肥处理组的番茄病指数据，来自图S2。意义：表明实验初始时两组病指无显著差异，抑病效果是长期连续种植过程中逐渐形成的。
未施肥处理组的番茄病指和根际病原菌丰度数据，来自图S3、图S4。意义：作为空白对照，证明施肥（尤其是有机肥）能显著降低青枯病的发生和病原菌的定殖。
有机肥和化肥处理组第2-6代根际miRNA的相对丰度动态数据，来自图S5、图S6。意义：展示miRNA丰度随种植代数增加而逐渐升高的趋势，与病指逐渐下降的趋势呈负相关，进一步支持miRNA的抑病作用。
实验初始土壤和有机肥的理化性质数据，来自表S1。意义：保证有机肥和化肥处理组的初始氮、磷、钾养分含量一致，排除了养分差异对实验结果的干扰。
青枯雷尔氏菌、有益菌及miRNA的qPCR引物序列，来自表S2、表S3。意义：提供了实验关键技术参数，保证了研究方法的可重复性。
8.结论
连续六代种植后，有机肥和等养分化肥处理均能诱导番茄青枯病抑病土壤的形成，且有机肥的抑病效果显著优于化肥，能更有效降低根际和植株内青枯雷尔氏菌的定殖量。
番茄根系可通过分泌类外泌体胞外囊泡将miRNA转运至根际土壤，有机肥处理显著上调了根际miRNA的丰度，其中sly-miR159的上调幅度最为显著。
sly-miR159和sly-miR319c-3p是调控根际免疫的核心miRNA：sly-miR159具有双向调控功能，既能抑制青枯雷尔氏菌的增殖，又能促进枯草芽孢杆菌和弗氏链霉菌的生长；sly-miR319c-3p则特异性抑制青枯雷尔氏菌的生长。
有机肥通过双重机制增强根际抑病能力：其可溶性大分子非微生物组分诱导番茄根系分泌关键miRNA，微生物组分则为根际提供初始有益微生物群落，两者协同作用实现对青枯病的高效防控。
本研究首次揭示了植物根系分泌miRNA作为跨界信号分子调控根际微生物组的新机制，拓展了植物根际免疫的“呼救”理论，为土传病害的绿色防控和微生物肥料的增效改良提供了重要的理论依据和技术支撑。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C自动微生物生长曲线分析仪，在28℃、中等振幅振荡培养条件下，每小时自动测定一次600 nm波长处的光密度（OD₆₀₀），连续监测30小时，获得了青枯雷尔氏菌FJAT-91、枯草芽孢杆菌、弗氏链霉菌在分别添加sly-miR159、sly-miR319c-3p、sly-miR166及阴性对照miRNA NC后的完整生长动力学曲线，数据来自图5B-I。其研究意义主要体现在以下六个方面：
动态、定量验证miRNA的生物学功能：传统的平板菌落计数法只能获得某个时间点的终点数据，无法反映微生物生长的全过程。Bioscreen的连续监测技术可以完整记录微生物的延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期，准确计算最大比生长速率、延迟期时长、最大生物量等关键动力学参数。例如，数据显示sly-miR159从接种后第11小时开始显著抑制青枯菌的对数生长期生长，而对弗氏链霉菌的促进作用从第3小时就已开始，这种时间依赖性的动态变化直接证明了miRNA对不同微生物的特异性调控作用，排除了非特异性的物理或化学干扰。
明确miRNA的作用时效和作用强度：通过生长曲线可以精确判断miRNA发挥作用的时间窗口和调控效率。例如，sly-miR159对青枯菌的抑制作用持续到第25小时，覆盖了整个对数生长期，说明其作用具有长效性；通过对比稳定期的OD₆₀₀最大值，可以定量计算出sly-miR159对青枯菌的抑制率约为45%，对弗氏链霉菌的促进率约为60%，这些定量数据为后续miRNA的田间应用剂量优化提供了重要参考。
严格排除阴性对照的干扰：实验专门设置了无义序列miRNA NC作为阴性对照，生长曲线结果显示miRNA NC对青枯菌、枯草芽孢杆菌和弗氏链霉菌的生长均无显著影响。这一结果有力证明了观察到的生长变化是由特定miRNA的序列特异性引起的，而不是核酸本身的理化性质、培养基成分变化或实验操作误差导致的，极大增强了实验结论的可靠性和特异性。
高通量、高重复性保障实验精度：Bioscreen仪器采用96孔板培养体系，可同时测定100个样品的生长曲线，本研究每个处理设置3个生物学重复，所有生长曲线的标准偏差均小于5%。这种高通量、自动化的检测方式不仅大大提高了实验效率，还避免了人工取样带来的操作误差，保证了数据的准确性和可重复性，为miRNA功能的精准验证提供了技术保障。
为分子机制研究提供关键线索：生长曲线的动态特征可以为后续的靶基因鉴定和机制解析提供重要方向。例如，sly-miR159对青枯菌的抑制作用发生在对数生长期早期，提示其可能靶向调控了与细胞分裂、DNA复制或初级代谢相关的基因；而对弗氏链霉菌的促进作用从延迟期就开始，提示其可能调控了与孢子萌发、细胞壁合成或早期生长相关的基因。这些线索为后续的转录组分析、双荧光素酶报告基因验证等分子机制研究指明了方向。
建立标准化的miRNA-微生物互作研究方法：本研究建立的基于Bioscreen C的miRNA与微生物互作测定方法，具有操作简便、数据客观、通量高、可重复性强等优点。该方法可推广应用于其他植物miRNA与根际微生物、病原微生物、内生微生物的互作研究，为该领域提供了一套标准化的实验技术平台，有助于推动植物-微生物跨界互作研究的发展。