Bacillus velezensis 20507 promotes symbiosis between Bradyrhizobium japonicum USDA110 and soybean by secreting flavonoids
贝勒泽氏芽孢杆菌20507通过分泌黄酮类物质促进日本缓根瘤菌USDA110与大豆的共生关系
来源：Front. Microbiol. 16:1572568.
1.摘要
根瘤菌与植物促生根际细菌（PGPR）共接种可提升大豆生长和结瘤效率，但不同氮供应水平（0–10 mmol/L）下贝勒泽氏芽孢杆菌20507与日本缓根瘤菌USDA110的互作机制尚不明确。本研究设置4个氮水平梯度，对大豆进行单菌和双菌共接种处理，测定了结瘤、生长、生理及氮含量指标；对缺氮条件下的大豆根系进行转录组测序，通过质谱鉴定贝勒泽氏芽孢杆菌发酵液中的黄酮类物质，并验证芦丁对根瘤菌结瘤基因NodD1/NodD2的调控作用。结果显示，所有氮水平下共接种均显著提升大豆结瘤、生物量和单株氮含量；缺氮条件下共接种诱导5367个差异表达基因，显著富集于苯丙烷类和黄酮类生物合成通路；贝勒泽氏芽孢杆菌可产生29种黄酮和4种异黄酮（包括芦丁），5–10 mg/L的芦丁可上调根瘤菌NodD1表达并抑制NodD2表达。综上，贝勒泽氏芽孢杆菌通过分泌黄酮类物质（尤其是芦丁）调控根瘤菌结瘤基因表达，进而促进其与大豆的共生，提升大豆氮同化和生长能力，该发现为开发大豆复合接种剂提供了理论基础。
2.关键词（中文）
大豆、转录组、生长、固氮、结瘤
3.研究目的
明确不同氮供应水平下，贝勒泽氏芽孢杆菌20507与日本缓根瘤菌USDA110共接种对大豆生长、结瘤及氮吸收的协同效应。
揭示两种微生物互作促进大豆-根瘤菌共生的分子机制，鉴定贝勒泽氏芽孢杆菌分泌的关键活性代谢物。
解析共接种条件下大豆根系的转录组重编程特征，阐明植物响应双菌互作的信号通路。
4.研究思路
采用全因子实验设计，设置0、2、5、10 mmol/L四个氮水平和空白对照、贝勒泽氏芽孢杆菌单接种、日本缓根瘤菌单接种、双菌共接种四个处理组。首先通过芬兰Bioscreen C系统测定不同氮水平下两菌单独及共培养的生长动力学，结合平板对峙实验验证菌株间的互作关系；随后开展盆栽实验，测定大豆幼苗的形态、生理、光合、结瘤及氮含量等表型指标；对缺氮条件下的大豆根系进行转录组测序，筛选差异表达基因并进行GO和KEGG富集分析；利用超高效液相色谱-质谱联用技术鉴定贝勒泽氏芽孢杆菌发酵液中的代谢物，重点分析黄酮类物质组成；最后通过qRT-PCR验证不同浓度芦丁对根瘤菌结瘤基因的调控作用及转录组结果的可靠性，综合解析双菌协同促进大豆共生固氮的分子机制。
5.研究亮点
首次发现贝勒泽氏芽孢杆菌可直接分泌黄酮类物质（而非传统报道的生长素或细胞分裂素）调控根瘤菌结瘤基因表达，明确了芦丁是介导两菌互作的关键信号分子。
揭示了贝勒泽氏芽孢杆菌与日本缓根瘤菌之间的代谢共生关系，证实两菌无拮抗作用且在缺氮条件下协同增殖，为复合微生物接种剂的配伍提供了科学依据。
系统解析了不同氮水平下双菌共接种的效应差异，发现缺氮条件下协同效应最显著，为大豆减氮施肥技术提供了新策略。
阐明了共接种通过反馈抑制大豆自身黄酮合成、上调生长素响应基因和氮转运基因促进植物生长的分子通路，完善了PGPR-根瘤菌-植物三元互作的理论体系。
6.可延伸的方向
开展田间试验验证双菌共接种剂在不同土壤类型和气候条件下的应用效果，优化接种剂量和施用方式。
利用CRISPR-Cas9技术构建贝勒泽氏芽孢杆菌黄酮合成关键基因的突变体，明确不同黄酮类物质对共生固氮的具体贡献。
探究贝勒泽氏芽孢杆菌分泌的其他代谢物（如脂肪酸、聚酮类）在两菌互作中的作用，挖掘更多协同增效的活性物质。
开发包含贝勒泽氏芽孢杆菌、根瘤菌及其他功能微生物的多菌复合接种剂，提升其在复杂土壤环境中的定殖能力和稳定性。
结合微生物转录组和蛋白质组技术，解析双菌共培养条件下的基因表达和蛋白互作网络，深入揭示代谢共生的分子机制。
7.测量的数据及其研究意义
大豆幼苗表型数据，来自图1A-D。意义：直观展示不同氮水平和接种处理对大豆整体生长状态的影响，初步判断双菌共接种的生长促进效应。
微生物生长动力学数据，来自图2A-C。意义：定量分析氮水平对两菌单独及共培养生长的影响，明确两菌的生长特性及互作关系。
菌株平板对峙实验数据，来自图2D-F。意义：直观验证贝勒泽氏芽孢杆菌与日本缓根瘤菌之间无拮抗作用，为代谢共生关系的提出提供表型证据。
大豆生长参数（株高、茎粗、叶面积、SPAD值）数据，来自图3A-D。意义：定量评估不同处理对大豆营养生长和叶绿素含量的影响，反映植物的光合潜力和健康状态。
大豆生物量及根瘤干重数据，来自图4A-B。意义：直接反映植物的物质积累能力和根瘤菌的结瘤效率，是评估共生固氮效果的核心指标。
大豆光合特性参数（净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度、水分利用效率）数据，来自图5A-D。意义：从生理水平解析双菌共接种促进大豆生长的机制，明确其对光合作用和水分利用的调控作用。
大豆不同组织（根、茎、叶）及全株氮含量数据，来自图6A-D。意义：定量评估不同处理对大豆氮吸收和分配的影响，直接反映共生固氮的效率。
差异表达基因（DEGs）数量及分布数据，来自图7A-C。意义：从转录组水平揭示不同接种处理对大豆根系基因表达的影响程度，明确双菌共接种的特异性调控效应。
差异表达基因GO富集分析数据，来自图8。意义：将差异基因按生物学过程、细胞组分和分子功能进行分类，明确共接种主要影响的植物生物学过程。
差异表达基因KEGG通路富集分析数据，来自图9。意义：筛选出共接种显著调控的代谢通路，重点定位到苯丙烷类和黄酮类生物合成通路，为机制解析提供方向。
贝勒泽氏芽孢杆菌发酵液代谢物分类及黄酮类物质组成数据，来自图10A-C。意义：全面鉴定菌株分泌的代谢物，明确黄酮类物质的种类和丰度，筛选出关键活性物质芦丁。
qRT-PCR验证数据，包括根瘤菌结瘤基因NodD1/NodD2表达及大豆差异基因表达，来自图11A-C。意义：验证转录组结果的可靠性，明确芦丁对根瘤菌结瘤基因的调控效应，证实分子机制的合理性。
转录组测序原始数据统计及比对结果，来自补充表S2、S3。意义：评估测序数据的质量和可靠性，为后续差异基因分析提供基础。
差异表达基因列表及功能注释，来自补充表S4、S5、S6、S9。意义：提供详细的基因表达变化信息，为深入挖掘关键调控基因提供数据支持。
贝勒泽氏芽孢杆菌基因组注释及黄酮合成相关基因信息，来自补充表S7。意义：从基因组水平证实菌株具备黄酮合成的遗传基础。
发酵液代谢物鉴定详细结果，来自补充表S8。意义：提供所有鉴定到的代谢物信息，为后续活性物质筛选提供完整数据集。
8.结论
贝勒泽氏芽孢杆菌20507与日本缓根瘤菌USDA110之间存在代谢共生关系，无拮抗作用，且在缺氮条件下协同增殖，双菌共接种在所有氮水平下均能显著提升大豆的生长、结瘤和氮吸收能力，缺氮条件下效果最显著。
贝勒泽氏芽孢杆菌可分泌29种黄酮和4种异黄酮，其中芦丁是关键活性物质，5–10 mg/L的芦丁可通过上调根瘤菌NodD1表达、抑制NodD2表达，激活结瘤信号通路，促进根瘤菌与大豆的共生。
双菌共接种可诱导大豆根系转录组重编程，显著富集苯丙烷类和黄酮类生物合成通路，但通过反馈抑制下调了大豆自身黄酮合成关键基因（PAL、CHS、CHI等）的表达，同时上调了氮转运基因（NPF家族）和生长素响应基因（GH3、SAUR）的表达，进而促进植物生长和氮同化。
本研究为开发高效大豆复合微生物接种剂提供了新的理论依据和菌株资源，对减少化学氮肥使用、实现农业可持续发展具有重要意义。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C系统在28℃、180 rpm条件下，连续7天每2小时测定一次OD600值，获得了不同氮水平（0、2、5、10 mmol/L）下贝勒泽氏芽孢杆菌单独培养、日本缓根瘤菌单独培养及两菌共培养的生长曲线，数据来自图2A-C。其研究意义主要体现在以下几个方面：
明确氮水平对两菌生长的调控规律：结果显示，无论是单培养还是共培养，两菌在缺氮条件（N0）下的最终生物量均显著高于氮补充条件（N2、N5、N10），表明低氮环境更有利于这两种根际微生物的生长繁殖，为后续盆栽实验中缺氮条件下协同效应最显著的结果提供了微生物生长层面的解释。
证实两菌的代谢共生关系：共培养条件下，N0组的最终OD600值（0.25）显著高于贝勒泽氏芽孢杆菌单培养（0.18）和日本缓根瘤菌单培养（0.13），结合平板对峙实验无拮抗现象的结果，直接证明两菌之间存在代谢共生关系，即通过代谢物交换实现相互促进生长，而非竞争或拮抗。
排除生长差异对实验结果的干扰：生长曲线显示，在所有氮水平下，共培养组的生长均优于单培养组，且两菌的生长趋势一致，说明后续观察到的大豆结瘤和生长促进效应并非由于某一菌株生长受抑制导致，而是两菌协同作用的结果。
为实验设计提供科学依据：通过生长曲线明确了两菌的对数生长期和稳定期，为后续发酵液制备、接种时间点选择以及代谢物取样时间点的确定提供了参考，确保实验在菌株生理状态一致的条件下进行。
为复合接种剂的生产提供指导：明确了缺氮条件下两菌的最佳生长条件，为大规模发酵生产复合接种剂时的培养基氮源优化提供了数据支持，有助于降低生产成本并提高接种剂的活菌数和活性。