Heterotrophic ammonia oxidation by Alcaligenes balances ROS generation and terminal electron transport
产碱杆菌的异养氨氧化平衡活性氧生成与末端电子传递
来源：October 2025 | Volume 4 | Issue 5 | 527–538 wileyonlinelibrary.com/journal/mLife
1.摘要
异养硝化细菌可在有机碳源存在下好氧氧化氨，这与自养硝化菌从氨氧化中获取能量用于细胞代谢和生长的机制不同，但异养氨氧化的生理意义数十年来一直不明确。本研究发现，以氮气（N₂）为主要产物的直接氨氧化（Dirammox）——一种异养氨氧化过程——与粪产碱杆菌（*Alcaligenes faecalis*）的氧化还原平衡和电子传递链密切相关。遗传和蛋白质组学研究表明，Dirammox基因（*dnfA/dnfB/dnfC*）的破坏会引发瞬时氧化还原失衡和能量代谢紊乱，进而导致细菌生长延迟。此外，生化和生理研究发现，内源性活性氧（ROS）会增强氨氧化的氧化还原通量，而细胞色素c过氧化物酶的基因敲除会使更多电子流向氨氧化途径，产生N₂和N₂O。这些意外发现为深入理解Dirammox过程和异养氨氧化的生理学机制提供了更全面的见解。
2.关键词（中文）
产碱杆菌、直接氨氧化、异养氨氧化
3.研究目的
破解异养氨氧化发现数十年但核心生理功能不明的科学难题，明确Dirammox过程对细菌生存和代谢的本质作用
揭示Dirammox与细胞氧化还原稳态、末端电子传递链及能量代谢之间的内在调控关系
阐明内源性活性氧（ROS）在Dirammox过程中的调控机制及生物学意义
验证Dirammox在细菌环境适应中的作用，修正此前仅将其视为氨解毒途径的片面认知
为构建高效脱氮工程菌和理解全球氮循环微生物过程提供理论基础
4.研究思路
首先以粪产碱杆菌JQ135为研究对象，构建Dirammox关键基因敲除突变株（Δ*dnfA*、Δ*dnfB*、Δ*dnfC*）及其回补互补菌株。通过芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪和多通道微量热仪，比较野生型与突变株在异养硝化培养基（HNM）中的生长动力学和呼吸热释放特征，初步明确*dnf*基因对细菌生长的影响。随后采用数据非依赖采集（DIA）蛋白质组学技术，系统分析野生型与突变株的差异表达蛋白，通过KEGG通路富集筛选出与氧化应激、氮代谢、TCA循环和氧化磷酸化相关的核心通路。接着利用多种荧光探针定量检测细胞内总ROS、活性氮（RNS）及各活性氧组分的水平，结合ROS抑制剂（BHT）和诱导剂（AAPH）处理实验，验证ROS对Dirammox的调控作用。进一步构建细胞色素c过氧化物酶（Δ*CCP*）和过氧化氢酶（Δ*CAT*）单敲除突变株，通过¹⁵N同位素示踪技术开展氮平衡实验，定量分析不同菌株的氮代谢通量变化。最后测定细胞内NADH/NAD⁺比值和ATP水平，结合电子传递链各复合物特异性抑制剂处理实验，明确Dirammox与末端电子传递链的偶联关系，整合所有数据构建Dirammox的生理功能调控模型。
5.研究亮点
首次揭示异养氨氧化（Dirammox）的核心生理功能是平衡细胞内ROS生成与末端电子传递，而非传统认为的仅用于高浓度氨解毒
发现内源性ROS可正向增强Dirammox的氧化还原通量，而细胞色素c过氧化物酶（CCP）通过清除ROS负向调控氨氧化速率，形成了精细的氧化还原反馈调节回路
证实Dirammox与电子传递链复合物IV（细胞色素c氧化酶）和V（ATP合酶）直接偶联，参与细胞能量代谢，敲除*dnf*基因会导致细胞内ATP水平显著下降
利用¹⁵N同位素示踪和定量蛋白质组学技术，系统阐明了Dirammox与TCA循环、氧化磷酸化及氧化应激响应的全局调控网络
证明Dirammox在常规氨浓度下对细菌从富营养环境到寡营养异养硝化环境的适应具有关键作用，拓展了对异养硝化细菌生理生态的认知
6.可延伸的方向
解析DnfA/B/C多酶复合物的三维晶体结构，明确其催化氨氧化的分子机制和电子传递路径
研究不同环境因子（如溶解氧、pH、温度、碳氮比）对Dirammox活性的调控规律，以及与硝化、反硝化等其他氮代谢途径的协同作用
开展宏基因组和宏转录组分析，评估Dirammox途径在自然环境（土壤、河流、海洋、污水处理厂）中的分布丰度和生态功能，量化其对全球氮循环的贡献
利用合成生物学手段优化Dirammox途径的表达调控，构建高效脱氮工程菌，应用于高氨氮废水处理和富营养化水体修复
探究假单胞菌、代尔夫特菌、微脉菌等含有*dnf*同源基因的细菌中的Dirammox过程，验证该生理机制的普遍性和进化保守性
结合单细胞转录组和代谢组技术，解析Dirammox在细菌群体中的异质性表达，以及细胞间的代谢互作关系
开发基于Dirammox途径的生物传感器，用于环境中氨氮的快速检测和生物修复效果的实时监测
7.测量的数据及其研究意义
细菌生长动力学数据：来自图1A野生型、Δ*dnfA/B/C*突变株及互补菌株在HNM中的生长曲线；来自图S1各菌株在LB培养基中的生长曲线；来自图S2添加20种氨基酸和维生素混合物后突变株在HNM中的生长曲线。这些数据直接证明了*dnf*基因的功能具有环境特异性，仅在以氨为主要氮源的HNM中对细菌生长适应至关重要，且排除了营养缺陷导致生长延迟的可能性。
呼吸热释放数据：来自图1B各菌株的热流曲线；来自图1C总呼吸热释放量。这些数据从能量代谢角度印证了生长曲线的结果，显示突变株的呼吸热释放峰值显著延后，且Δ*dnfA*和Δ*dnfB*突变株的总呼吸热释放量低于野生型，反映了Dirammox功能缺失对细胞能量代谢的影响。
蛋白质组学数据：来自图2A主成分分析（PCA）图；来自图2B UpSet韦恩图；来自图2C KEGG通路富集散点图；来自图2D代谢通路示意图。这些数据揭示了敲除*dnf*基因后，细菌有1336个共同差异表达蛋白，主要富集在核糖体、TCA循环、氧化磷酸化和氧化应激等通路，为后续机制研究提供了全局分子视角。
氧化应激水平数据：来自图3A总ROS水平；来自图3B总RNS水平；来自图3C BHT和AAPH处理后的ROS水平；来自图3D BHT和AAPH处理后的羟胺积累量；来自图S4 O₂⁻、H₂O₂和OH•的水平。这些数据证明了Dirammox过程可消耗内源性ROS，而ROS积累会正向促进氨氧化通量，建立了ROS与Dirammox之间的因果调控关系。
氮代谢通量数据：来自图3E野生型、Δ*CAT*和Δ*CCP*突变株的氮平衡实验结果；来自图3F不同菌株的N₂、N₂O和NO₂⁻生成量。这些数据证实了CCP通过清除ROS负向调控Dirammox，敲除*CCP*会使更多氮流向氨氧化途径，N₂生成量从17.8%提升至22.8%，同时产生大量N₂O。
能量代谢和电子传递数据：来自图4A NADH/NAD⁺总浓度和比值；来自图4B细胞内ATP水平；来自图4C电子传递链抑制剂处理后的羟胺积累量；来自图4D CO和白皮杉醇处理后的N₂生成量。这些数据证明了Dirammox与细胞氧化还原平衡密切相关，且电子传递链复合物IV和V是Dirammox正常进行的必要条件。
氨浓度梯度生长数据：来自图S5不同氨浓度下野生型和突变株的生长曲线。这些数据证明了突变株的生长延迟并非由氨毒性引起，进一步修正了Dirammox仅用于氨解毒的观点。
8.结论
本研究系统阐明了粪产碱杆菌中异养氨氧化（Dirammox）的核心生理功能是平衡细胞内活性氧（ROS）生成与末端电子传递。敲除Dirammox关键基因*dnfA/B/C*会导致细胞内ROS异常积累、氧化还原稳态失衡和ATP水平下降，进而引起细菌从LB培养基转移到HNM培养基后的生长延迟。内源性ROS可正向增强Dirammox的氧化还原通量，而细胞色素c过氧化物酶（CCP）通过清除ROS负向调控氨氧化速率，形成了精细的氧化还原反馈调节机制。Dirammox与电子传递链复合物IV和V直接偶联，参与细胞能量代谢，其活性受细胞内ATP水平和电子传递效率的调控。这些发现修正了此前关于异养氨氧化仅用于高浓度氨解毒的片面认知，揭示了其在细菌氧化还原稳态维持和环境适应中的重要作用，为高效脱氮微生物的构建和全球氮循环的理解提供了重要的理论基础。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪，测定了图1A中粪产碱杆菌野生型、Δ*dnfA/B/C*突变株及互补菌株在异养硝化培养基（HNM）中的生长曲线，每30分钟自动测定一次OD₆₀₀，连续监测约35小时；同时测定了图S1中各菌株在LB培养基中的生长曲线，以及图S2中添加20种氨基酸和维生素混合物后突变株在HNM中的生长曲线。这些数据在本研究中具有以下不可替代的核心研究意义：
直接确立Dirammox基因的生理功能表型：Bioscreen的高通量连续监测特性，精准捕捉到了野生型与突变株在不同培养基中的生长差异。结果显示，在富营养的LB培养基中，野生型与突变株的生长曲线完全重合，说明*dnf*基因不参与细菌的基础生长代谢；而在以氨为主要氮源的HNM培养基中，突变株的延迟期从野生型的15小时延长至20-25小时，且互补菌株可完全恢复生长表型。这一表型差异直接证明了Dirammox过程对细菌在特定环境中的生长适应具有关键作用，是本研究所有后续机制探索的基础。
排除营养缺陷的干扰因素：通过测定添加20种氨基酸和维生素混合物后突变株的生长曲线（图S2），发现营养补充无法恢复突变株的生长缺陷，直接排除了氨基酸或维生素营养缺陷导致生长延迟的可能性，将研究焦点锁定在Dirammox功能缺失本身，避免了实验结论的偏差。
精确量化生长动力学参数：Bioscreen的高密度数据采集能够精确计算各菌株的延迟期长度、比生长速率和最大OD₆₀₀。结果显示，突变株进入对数生长期后的比生长速率与野生型无显著差异，但延迟期显著延长。这一发现表明Dirammox功能缺失主要影响细菌的环境适应过程，而非对数生长期的增殖能力，为理解其生理作用提供了关键线索——即Dirammox主要参与环境胁迫下的氧化还原稳态维持，帮助细菌快速适应新的营养环境。
为后续实验提供标准化取样依据：生长曲线数据明确了各菌株进入对数生长期中期（OD₆₀₀≈0.9）的准确时间点，为蛋白质组学取样、ROS检测、ATP测定、NADH/NAD⁺分析等所有后续实验提供了统一的取样标准，确保所有样品均处于相同的生长阶段，最大限度地减少了生长阶段差异对实验结果的干扰，保证了数据的可比性和可靠性。
与呼吸热数据形成交叉验证：Bioscreen测定的生长曲线与微量热仪测定的呼吸热释放曲线（图1B）高度一致，突变株的生长延迟与呼吸热释放峰值延后完全同步。这种从生长表型和能量代谢两个独立维度的交叉验证，极大地增强了实验结论的说服力，证明了Dirammox功能缺失确实会导致细菌整体生理状态的改变。
保证实验的可重复性和标准化：Bioscreen仪器采用全自动化的培养和检测流程，每个菌株设置3个生物学重复，培养条件（温度、振荡速度、培养基体积）完全标准化，生长曲线的变异系数小于5%。这种高重复性和标准化的数据，为后续的统计分析和结论推导提供了坚实的基础，也使得该研究结果能够被其他实验室重复和验证。