Transcriptomic profiling of Debaryomyces hansenii reveals detoxification and stress responses to benzo(a)pyrene exposure
对汉森德巴利酵母的转录组分析揭示了对苯并(a)芘暴露的解毒和应激反应
来源：October 2025 Volume 91 Issue 10 10.1128/aem.01557-25
1.摘要
多环芳烃（PAHs）如苯并(a)芘（BaP）的环境积累因其持久性、致突变性和明确的致癌性，对生态系统和公共健康构成重大威胁。本研究调查了极端嗜盐酵母汉森德巴利酵母（*Debaryomyces hansenii*）在营养匮乏条件下激活特异性解毒机制降解BaP的能力。当暴露于100 ppm BaP时，D. hansenii在3天内消除了超过70%的污染物，同时保持正常的生长动态。RNA-Seq分析显示广泛的转录重编程，在仅BaP条件下有1179个基因上调、1031个下调；在共代谢暴露（2%葡萄糖+100 ppm BaP）下有1067个上调、977个下调，涉及总6506个注释基因。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析突出了异生物质降解途径的激活，特别是细胞色素P450单加氧酶、环氧化物水解酶和谷胱甘肽S-转移酶，同时伴随增强的抗氧化反应和精细调节的谷胱甘肽稳态。这项工作首次呈现了D. hansenii中BaP解毒的全基因组转录组图谱，揭示了与应激适应和解毒相关基因的复杂转录调控网络，表明D. hansenii有望成为极端环境生物修复的真核生物平台。
2.关键词（中文）
汉森德巴利酵母、极端嗜盐酵母、多环芳烃、苯并(a)芘、生物修复、真菌修复、转录组学、异生物质代谢、解毒系统、氧化还原稳态
3.研究目的
填补极端嗜盐酵母应对BaP胁迫的转录组研究空白，系统揭示其分子解毒机制
评估D. hansenii在葡萄糖限制和共代谢两种条件下的BaP降解能力和生长适应性
鉴定参与BaP解毒、氧化应激防御和代谢重编程的关键基因与核心通路
阐明葡萄糖作为共底物对BaP降解效率和转录响应的调控作用
验证D. hansenii作为高盐、低温等极端污染环境中PAHs生物修复真核底盘的应用潜力
4.研究思路
首先通过固体平板点样实验初步评估D. hansenii对100 ppm BaP的耐受性，使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪连续测定四种条件（YNB、YNBG、YNB+BaP、YNBG+BaP）下的液体培养生长动力学，结合干重法验证生物量变化。随后通过荧光分光光度法和GC-MS定量分析BaP降解效率，设置无细胞培养基和热灭活细胞两个阴性对照，排除吸附、挥发等非生物损失的干扰。在降解速率趋于稳定的72小时收集样品，分别进行葡萄糖限制和共代谢条件下的RNA-Seq测序，通过差异表达分析、GO和KEGG功能富集，重点关注解毒相关基因家族和氧化应激通路的表达变化，并通过RT-qPCR验证转录组结果的可靠性。最后整合生理和转录组数据，构建D. hansenii应对BaP暴露的五层级适应性响应模型。
5.研究亮点
首次报道极端嗜盐酵母D. hansenii应对BaP胁迫的全基因组转录组图谱，填补了非丝状真菌PAHs降解分子机制的研究空白
证明D. hansenii在葡萄糖匮乏条件下仍能高效降解BaP（3天降解率>70%），共代谢条件下降解效率进一步提升至73.1%，且能耐受高达500 ppm的BaP浓度
系统鉴定了参与BaP解毒的核心基因家族，包括4个CYP基因（含已验证的DhDIT2）、2个环氧化物水解酶基因和5个谷胱甘肽S-转移酶基因，揭示了谷胱甘肽稳态在抗氧化防御中的核心作用
发现D. hansenii通过激活乙醛酸循环、磷酸戊糖途径和β-氧化进行代谢重编程，在能量受限条件下优先保障解毒功能和细胞存活
构建了包含异生物质活化、抗氧化防御、代谢物结合与外排、代谢重编程和膜重塑的五层级适应性响应模型，为真核生物PAHs解毒机制提供了全面的分子框架
6.可延伸的方向
结合代谢组学和蛋白质组学技术，全面解析BaP在D. hansenii中的完整降解途径和中间代谢产物，验证其是否能实现完全矿化
过表达关键解毒基因（如DhDIT2、DEHA2C02596g）构建工程化菌株，进一步提高BaP降解效率并拓展底物范围至其他高分子量PAHs
研究D. hansenii在高盐、低温、重金属等多重胁迫条件下的BaP降解能力，评估其在海洋溢油、盐渍土壤等极端污染环境中的实际应用潜力
开发海藻酸钠、生物炭等固定化细胞技术，优化菌剂制备和投加工艺，开展海洋沉积物和工业废水的现场修复中试试验
构建D. hansenii与盐单胞菌、假单胞菌等耐盐细菌的合成菌群，利用种间协同作用提升复杂PAHs混合物的修复效率
引入污染物响应型自杀开关等生物安全控制系统，确保工程菌株在完成修复任务后能自动从环境中清除
7.测量的数据及其研究意义
菌株耐受性和生长数据：来自图1a固体培养基点样生长结果；来自图1b Bioscreen C测定的液体培养生长曲线；来自图1c干重法测定的生物量变化。这些数据直观证明了D. hansenii能够耐受100 ppm BaP并在其作为唯一碳源时生长，定量分析了BaP暴露对菌株代时和生物量积累的影响，为后续转录组实验的时间点选择提供了关键依据。
BaP降解效率数据：来自图1d荧光分光光度法测定的6天降解动力学；来自图S2 GC-MS验证的降解产物图谱。这些数据准确量化了D. hansenii在两种条件下的BaP降解效率，排除了吸附和挥发等非生物因素的干扰，证明了其真实的生物降解能力。
葡萄糖消耗数据：来自图1e葡萄糖氧化酶法测定的葡萄糖消耗曲线。这些数据揭示了BaP暴露对葡萄糖代谢的抑制作用（6天消耗率从78%降至64.5%），表明菌株在共代谢条件下发生了代谢重定向，部分利用BaP作为替代碳源。
转录组测序数据：来自图2a葡萄糖限制条件下的主成分分析（PCA）结果；来自图2b葡萄糖限制条件下的差异表达基因火山图；来自图2c葡萄糖限制条件下的前20个差异表达基因热图；来自图2d葡萄糖限制条件下的RT-qPCR验证结果；来自图5a共代谢条件下的PCA结果；来自图5b共代谢条件下的火山图；来自图5c共代谢条件下的前20个差异表达基因热图；来自图5d共代谢条件下的RT-qPCR验证结果。这些数据全面展示了D. hansenii在BaP胁迫下的转录重编程，鉴定了超过2000个差异表达基因，通过RT-qPCR验证了结果的可靠性，为后续功能富集分析奠定了基础。
功能富集分析数据：来自图3a葡萄糖限制条件下的GO富集分析结果；来自图3b葡萄糖限制条件下的KEGG富集分析结果；来自图6a共代谢条件下的GO富集分析结果；来自图6b共代谢条件下的KEGG富集分析结果。这些数据系统揭示了BaP胁迫下激活的主要生物学过程和代谢通路，突出了解毒、氧化还原稳态和能量代谢的核心作用。
解毒相关基因表达数据：来自图4a葡萄糖限制条件下27个解毒相关基因的RNA-Seq表达热图；来自图4b葡萄糖限制条件下的RT-qPCR验证结果；来自图7a共代谢条件下的解毒基因表达热图；来自图7b共代谢条件下的RT-qPCR验证结果。这些数据明确了参与BaP解毒的关键酶类及其表达水平，证明了CYP-EH-GST三级解毒系统的协同作用。
潜在降解产物数据：来自图S5 GC-MS检测的BaP降解中间产物图谱。这些数据初步揭示了BaP在D. hansenii中的降解途径，检测到邻苯二甲酸酯衍生物、取代酚类和羧酸类等产物，为后续代谢组学研究提供了重要线索。
8.结论
本研究证实汉森德巴利酵母D. hansenii在葡萄糖限制和葡萄糖补充两种条件下均能生长并降解苯并(a)芘，展现出在胁迫环境中卓越的代谢适应性。虽然BaP单独作为碳源即可支持生长和降解，但与葡萄糖共代谢显著提高了生物量积累和降解效率，这可能是因为葡萄糖作为主要能量来源，为菌株生长和BaP降解所需的酶促反应提供了充足的ATP和NADPH。转录组分析显示两种条件均触发了经典的真核生物解毒反应，包括CYP介导的I相氧化、基于谷胱甘肽的II相结合、抗氧化酶激活和膜重塑。共代谢条件进一步促进了磷酸戊糖途径等能量产生通路，这对于NADPH的生成和高效解毒至关重要。虽然预期GABA分流在氧化还原平衡中发挥作用，但其转录调控并不明显，表明存在其他代偿机制。这些发现表明D. hansenii是一种代谢灵活的极端嗜盐酵母，能够通过整合解毒、抗氧化防御、膜重塑、分解代谢和代谢适应的转录程序降解BaP，为未来开发适用于高盐、低温等恶劣环境的生物修复技术提供了重要的理论基础和底盘资源。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪，测定了图1b中D. hansenii在四种不同条件（YNB、YNBG、YNB+100 ppm BaP、YNBG+100 ppm BaP）下的生长动力学，每小时自动测定一次OD₆₀₀，连续监测6天。这些数据在本研究中具有以下不可替代的核心研究意义：
定量评估BaP的毒性效应和菌株耐受性：通过生长曲线精确计算了不同条件下的代时，YNB条件下为10.0±0.04小时，YNBG条件下为7.5±0.02小时，YNB+BaP条件下延长至18.3±2.7小时，YNBG+BaP条件下为11.7±1.5小时。这一定量数据清晰表明BaP暴露会对菌株造成显著的代谢负担，延长世代时间，但D. hansenii仍能维持生长，证明其对BaP具有较强的耐受性，远优于大多数传统的生物修复菌株。
确定转录组分析的最佳时间点：生长曲线显示所有条件下菌株均在48小时内进入稳定期，且结合图1d的降解动力学数据，BaP降解速率在72小时达到稳定。这一结果为选择72小时作为转录组取样时间点提供了科学依据，确保取样时菌株处于降解活性最高的阶段，能够捕获最全面的解毒相关基因表达信息，避免了在对数生长期或降解初期取样导致的信息缺失。
验证干重法生物量测定结果：Bioscreen测定的OD₆₀₀变化趋势与图1c的干重法结果高度一致，两种方法相互印证，提高了生物量数据的可靠性。同时，Bioscreen的高通量和连续监测特性弥补了干重法只能离散取样的不足，能够更精细地反映菌株的生长动态，准确捕捉延迟期、对数生长期和稳定期的转折点。
区分不同培养条件下的生长差异：生长曲线清晰显示，在葡萄糖存在的条件下（YNBG、YNBG+BaP），菌株的生长速率和最终生物量显著高于葡萄糖限制条件（YNB、YNB+BaP）。这一差异为后续比较两种条件下的转录响应提供了重要的生理基础，有助于区分葡萄糖代谢和BaP解毒对基因表达的独立影响，准确鉴定真正响应BaP胁迫的基因。
评估代谢负担对生长的影响：通过比较相同葡萄糖浓度下有无BaP的生长曲线（YNBG vs YNBG+BaP），定量分析了BaP解毒过程对菌株生长的影响。结果表明，BaP暴露使代时延长了56%，但最终生物量并未显著降低，说明D. hansenii能够通过代谢重编程在解毒和生长之间取得平衡，将有限的能量优先分配给解毒过程以维持细胞存活。
为工业化应用提供关键工艺参数：生长曲线数据明确了D. hansenii的延迟期约为6-8小时，对数生长期约为30-40小时，平台期生物量OD₆₀₀可达1.0-1.2。这些参数是大规模发酵罐工艺设计的核心依据，可直接用于确定发酵周期、补料速率、通气量和最佳收获时间，为菌剂的工业化生产和大规模应用提供指导。
保证实验数据的可重复性和标准化：Bioscreen仪器采用标准化的培养条件（恒温28℃、连续轨道振荡）和统一的光学检测系统，最大限度地减少了人工操作带来的系统误差和随机误差。所有生长实验均设置了三个生物学重复，数据的变异系数小于5%，为后续的统计分析和结论推导提供了坚实可靠的数据基础，确保了研究结果的可重复性。