Isolation of a novel manganese-oxidizing bacterium Lysinibacillus xylanilyticus M125: characterization, structural evolution, and Cd-adsorption activity of biogenic Mn oxides produced by the strain
新型氧化锰细菌木糖赖氨酸芽孢杆菌M125的分离：该菌株产生的生物源氧化锰的特性分析、结构演化及镉吸附活性
来源：Front. Microbiol. 16:1622784
1.摘要
锰氧化细菌在将可溶性Mn(II)转化为不溶性Mn(III/IV)氧化物的过程中发挥着关键作用，其产物被广泛应用于环境修复尤其是重金属污染治理领域。本研究从电镀厂附近的锰污染土壤中，通过添加10 mmol/L氯化锰的选择性LB培养基富集分离，结合Leucoberbelin Blue（LBB）显色法筛选得到一株具有强锰氧化能力的菌株。经菌落形态、革兰氏染色、生理生化分析、16S rRNA测序及系统发育分析，该菌株被鉴定为木糖赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus xylanilyticus）M125。研究系统考察了pH、温度和Mn²⁺浓度对菌株生长及锰氧化活性的影响，结果表明该菌株在pH 5.0-10.0、温度15-40℃范围内生长良好，可耐受高达60 mM的Mn²⁺；其锰氧化活性随Mn²⁺浓度升高至12 mM时达到峰值，且在高pH条件下有所增强。通过透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）等技术对菌株产生的生物源氧化锰（BioMnOₓ）进行表征，发现其为无定形MnO₂和结晶Mn₃O₄的混合相，呈现纳米片和被鞘包裹的球状两种形态，且随培养时间延长会发生从无定形向结晶相的结构演化。镉吸附实验结果显示，游离菌株、海藻酸钠固定化菌株及纯化的BioMnOₓ对水中镉离子的去除率均超过99.5%，展现出优异的镉污染修复潜力。本研究为锰和镉复合污染的生物修复提供了新的微生物资源和理论依据。
2.关键词（中文）
木糖赖氨酸芽孢杆菌、锰氧化细菌、生物源氧化锰、结构分析、镉吸附
3.研究目的
从电镀厂周边的锰污染土壤中筛选分离具有高效锰氧化能力的新型细菌菌株，丰富锰氧化细菌的菌种资源库。
系统解析菌株M125的生长特性和锰氧化能力，明确pH、温度、Mn²⁺浓度等环境因子对其生长和锰氧化的影响规律，确定最佳培养条件。
全面表征菌株产生的BioMnOₓ的微观形态、晶体结构、元素组成和化学价态，揭示其形成过程和长期培养下的结构演化机制。
评估游离菌株、固定化菌株及纯化BioMnOₓ对镉离子的吸附性能，验证其在重金属污染修复中的实际应用潜力。
4.研究思路
首先采用添加MnCl₂的选择性培养基对污染土壤样品进行富集培养，通过梯度稀释涂布和LBB显色法筛选出具有锰氧化活性的单菌落。对目标菌株进行形态学观察、生理生化试验和16S rRNA基因测序，结合系统发育分析完成分类鉴定。随后利用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪和LBB比色法，分别测定不同pH、温度和Mn²⁺浓度下菌株的OD₆₀₀和锰氧化产物的OD₆₂₀，绘制生长曲线和锰氧化动力学曲线，确定最优培养参数。在最优条件下大规模培养菌株，分别收集培养23天和90天的BioMnOₓ样品，通过TEM、XRD、XPS、FTIR及EDS能谱分析，系统研究BioMnOₓ的结构特征和时间依赖性演化规律。最后制备游离菌液、海藻酸钠固定化凝胶珠和纯化BioMnOₓ三种材料，通过ICP-MS测定其对1 mM Cd²⁺的吸附效率，综合评估其修复应用价值。
5.研究亮点
首次报道了木糖赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus xylanilyticus）的锰氧化特性，发现该菌株具有极强的环境适应性，可耐受60 mM高浓度Mn²⁺，且在宽pH和温度范围内保持生长和氧化活性，适合复杂污染环境的修复应用。
揭示了BioMnOₓ独特的双相结构演化过程：初期以无定形δ-MnO₂为主，长期培养后逐渐转化为无定形MnO₂与结晶Mn₃O₄的混合相，同时存在纳米片和球状两种典型形貌，丰富了对生物源氧化锰结构多样性的认知。
证明该菌株产生的BioMnOₓ是一种有机-无机复合体系，球状氧化锰的形成与细菌胞外鞘密切相关，为理解微生物介导的锰氧化和矿物形成机制提供了新的实验证据。
验证了三种应用形式（游离菌、固定化菌、纯化BioMnOₓ）均具有超过99.5%的镉去除率，其中固定化凝胶珠兼具高活性和易回收的优势，为实际工程应用提供了可行的技术方案。
6.可延伸的方向
开展转录组和蛋白质组分析，鉴定菌株M125中参与锰氧化的关键酶（如多铜氧化酶）和调控基因，阐明其分子调控机制。
优化海藻酸钠固定化工艺，引入生物炭等载体提高凝胶珠的机械强度和重复使用性，开发适合大规模应用的生物修复剂。
研究BioMnOₓ对铅、铜、锌等其他重金属以及抗生素、染料等有机污染物的吸附和氧化降解能力，拓展其在复合污染治理中的应用。
开展土壤和水体的原位修复中试试验，评估菌株在实际环境中的定殖能力和修复效果，优化投加量和修复周期等工艺参数。
探索生物源氧化锰在锂离子电池正极材料、高级氧化催化剂等领域的资源化利用潜力，实现污染治理与资源回收的协同。
构建菌株M125与其他功能微生物的复合修复体系，利用协同作用提高复杂污染环境的修复效率。
7.测量的数据及其研究意义
菌株鉴定数据：来自图1（a）菌株M125的TEM形态图，显示其为杆状、周生鞭毛的细菌；来自图1（b）基于16S rRNA的系统发育树，证明该菌株与木糖赖氨酸芽孢杆菌的同源性超过98%；来自表1菌株的生理生化特性和革兰氏染色结果，显示其为革兰氏阳性菌，具有脲酶、过氧化氢酶活性等特征。这些数据共同完成了菌株的准确分类鉴定，为后续研究奠定了分类学基础。
菌株生长特性数据：来自图2菌株M125的标准生长曲线，显示其在60小时左右进入稳定期，最大OD₆₀₀达到1.0-1.2；来自图3（a）不同pH下的生长数据，显示其在pH 5.0-10.0范围内生长良好；来自图3（b）不同温度下的生长数据，显示最适生长温度为30-35℃；来自图3（c）不同Mn²⁺浓度下的生长数据，显示其Mn²⁺耐受上限为60 mM。这些数据明确了菌株的生长动力学参数和环境适应性范围，为培养条件优化和应用场景筛选提供了依据。
锰氧化特性数据：来自图4（a）不同Mn²⁺浓度下的锰氧化水平，显示12 mM为最佳氧化浓度；来自图4（b）12 mM Mn²⁺下菌株生长与锰氧化的时间进程，显示锰氧化与菌株生长呈正相关；来自补充图S2不同pH下的锰氧化水平，显示高pH有利于锰氧化。这些数据确定了菌株锰氧化的最佳条件，为高效生产BioMnOₓ提供了指导。
BioMnOₓ结构表征数据：来自图5培养23天BioMnOₓ的XRD图谱和TEM图像，证明其主要为无定形结构，存在纳米片和球状两种形态；来自图6球状BioMnOₓ的TEM图像、EDS能谱及元素分布图，证实其为含Mn、O及C、N、P的有机-无机复合物；来自图7培养23天的菌株与胞外BioMnOₓ的TEM分析，显示大量游离的胞外球状氧化锰；来自图8培养90天BioMnOₓ的XRD和TEM分析，揭示了其向结晶Mn₃O₄转化的结构演化过程；来自图9 BioMnOₓ的XPS和FTIR光谱，进一步验证了Mn的多价态存在和有机组分的特征。这些数据全面阐明了BioMnOₓ的结构、组成和演化规律，为解释其优异的吸附性能提供了理论基础。
镉吸附性能数据：来自图10菌株M125在1 mM Cd²⁺下的生长曲线，证明其对镉具有良好的耐受性；来自图11三种材料的镉残留浓度和去除率数据，显示游离菌、固定化菌和BioMnOₓ的镉去除率分别为99.96%、99.52%和99.97%。这些数据直接证明了该菌株及其产物在镉污染修复中的高效性和实用性。
8.结论
本研究成功从电镀厂周边锰污染土壤中分离得到一株新型高效锰氧化细菌Lysinibacillus xylanilyticus M125，该菌株具有广泛的环境适应性，能在pH 5.0-10.0、温度15-40℃和Mn²⁺浓度高达60 mM的条件下生长，其锰氧化活性在Mn²⁺浓度12 mM、pH 7.0、温度35℃时达到最高。菌株产生的生物源氧化锰是一种有机-无机复合体系，初期主要为无定形δ-MnO₂，呈现纳米片和被胞外鞘包裹的球状两种形态；随着培养时间延长至90天，会发生明显的结构演化，形成无定形MnO₂与结晶Mn₃O₄的混合相。该菌株及其产生的BioMnOₓ对镉离子具有极强的吸附能力，三种应用形式的镉去除率均超过99.5%，且海藻酸钠固定化菌株保持了高活性并便于回收。综上，Lysinibacillus xylanilyticus M125及其生物源氧化锰是极具潜力的生物修复材料，可有效应用于锰和镉复合污染的土壤和水体治理。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪，测定了三组关键的微生物生长数据：菌株M125在标准LB培养基中的基础生长曲线（图2）、不同pH、温度和Mn²⁺浓度条件下的生长特性曲线（图3a、3b、3c），以及菌株在1 mM Cd²⁺胁迫下的生长曲线（图10）。这些数据在本研究中具有不可替代的核心研究意义：
精准刻画菌株基础生长动力学：仪器每间隔一定时间自动测定OD₆₀₀，连续监测60小时，精确划分了菌株的延迟期、对数生长期和稳定期，明确了其最大比生长速率和平台期生物量。这一数据为后续所有实验的接种量、培养时间和取样节点的确定提供了标准化依据，确保了不同批次实验的可比性和可重复性。
高通量评估环境适应性：Bioscreen C可同时处理100个样品，支持多梯度平行实验，使得本研究能够在短时间内完成6个pH梯度、8个温度梯度和8个Mn²⁺浓度梯度的生长测定，获得了大量可靠的平行数据。这些数据系统揭示了菌株对关键环境因子的耐受范围和最适条件，证明其具有极强的环境鲁棒性，为其在不同污染场地的应用提供了重要的可行性依据。
直接验证重金属耐受性：通过测定菌株在1 mM高浓度Cd²⁺下的生长曲线，证明其在镉胁迫下仍能保持正常的生长速率和生物量，这是菌株能够在镉污染环境中存活并发挥修复功能的前提条件。如果菌株本身对镉敏感，即使其产物具有高吸附性，也无法在实际污染环境中定殖和发挥作用，因此这一数据直接确立了该菌株的应用价值。
关联生长与锰氧化过程：结合LBB法测定的锰氧化动力学数据（图4b），发现锰氧化速率与菌株生长速率呈显著正相关，表明锰氧化是一个依赖于细菌代谢活性的过程，主要发生在对数生长期。这一发现为后续研究锰氧化的分子机制指明了方向，提示应重点关注对数生长期高表达的氧化酶基因。
保证数据的高精度和可靠性：仪器采用标准化的恒温培养和轨道振荡系统，以及统一的光学检测模块，最大限度地减少了人工操作带来的系统误差和随机误差。所有生长实验均设置了多个生物学重复，数据的变异系数小于5%，为后续的统计分析和结论推导提供了坚实的数据支撑。
为工业化应用提供工艺参数：生长曲线数据明确了菌株的最佳培养周期和生物量积累规律，为大规模发酵生产生物修复剂提供了关键的工艺参数。例如，确定在对数生长期后期（约48小时）收集菌体，可获得最高的活性和生物量，从而降低生产成本，提高修复效率。