Screening of Bacteria Promoting Carbon Fixation in Chlorella vulgaris Under High Concentration CO2 Stress
在高浓度CO₂胁迫下促进普通小球藻碳固定的细菌筛选
来源：Biology 2025, 14, 157.
1.摘要
微藻与细菌的协同作用可提高微藻的碳固定效率。本研究构建了高浓度CO₂胁迫下的微藻-细菌共存系统，采用16S rDNA技术分析了整个系统的细菌群落结构，筛选出微杆菌属（Microbacterium sp.）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）和气单胞菌属（Aeromonas sp.）三株能显著促进普通小球藻HL 01碳固定的细菌。其中气单胞菌属+普通小球藻HL 01实验组效果最显著，最终生物量产量较对照组提高约24%，第7天单日碳固定效率提高约245%。微藻与细菌共生的连续培养实验表明，细菌可利用微藻分泌的化合物生长，并产生营养物质维持微藻活力。通过激发-发射矩阵光谱分析培养液中的微生物胞外有机物，发现细菌利用了普通小球藻HL 01分泌的芳香蛋白类等物质，并产生了普通小球藻HL 01所需的新胞外有机物。液相色谱-质谱分析实验组与对照组培养液中的代谢有机物，发现31种普通小球藻HL 01特有的有机物被细菌利用，同时产生了136种新有机物，这些差异化合物主要为有机酸及其衍生物、苯类化合物和有机杂环化合物等。研究结果充分证明，通过微藻与细菌之间的物质交换，普通小球藻HL 01的碳固定能力和持续性得到了提升。本研究建立了筛选固碳共生细菌的方法，验证了微藻与细菌通过物质交换可显著提高微藻对高浓度CO₂的碳固定效率，为微藻-细菌协同固碳的进一步研究奠定了基础。
2.关键词（中文）
普通小球藻CO₂固定、高CO₂浓度、微藻-细菌系统、共生细菌
3.研究目的
弥补现有微藻固碳研究中忽略细菌作用的不足，解决单一微藻体系在高浓度工业烟气CO₂条件下固碳效率低、稳定性差的问题。
构建15%（v/v）高浓度CO₂（模拟燃煤电厂烟气浓度）胁迫下的普通小球藻HL 01-细菌共生系统，通过长期驯化筛选能显著促进小球藻碳固定的特异性共生细菌。
系统解析微藻与细菌之间的物质交换机制，明确细菌促进小球藻碳固定的分子基础。
为开发高效、稳定的微藻-细菌协同固碳技术提供新的菌种资源和理论依据，推动工业CO₂减排技术的发展。
4.研究思路
首先构建柱式光生物反应器，加入从中国西部高碳酸氢盐天然水体分离的普通小球藻HL 01和城市污水处理厂沉淀池出水，以15%（v/v）CO₂为唯一碳源，在自然光照条件下进行120天的长期胁迫驯化，获得稳定的微藻-细菌共生系统。通过16S rDNA高通量测序分析驯化后系统中的细菌群落结构，明确优势菌属。采用梯度稀释涂布法从共生系统中分离纯化单菌落细菌，使用芬兰Bioscreen FP-1100-C全自动生长曲线分析仪测定各菌株的生长动力学特性，结合革兰氏染色和16S rDNA测序进行菌种鉴定。将筛选出的优势菌株与普通小球藻HL 01进行共培养实验，定期测定生物量干重并计算CO₂固定效率，评估各菌株的促碳固定效果。最后通过激发-发射矩阵光谱（EEM）和超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-Q Exactive HF-X）技术，分析共培养体系中胞外有机物的组成变化，揭示微藻与细菌之间的物质交换机制。
5.研究亮点
首次在15%工业烟气浓度CO₂的长期胁迫下驯化微藻-细菌共生系统，筛选出三株具有显著促碳固定效果的细菌，其中气单胞菌属菌株使小球藻单日碳固定效率提升245%，是目前报道的促生效果最显著的菌株之一。
发现经过高CO₂胁迫驯化的细菌发生了适应性进化，具有显著延长的对数生长期（24-38h）和稳定期（持续至72h无衰亡），能够与小球藻的生长周期精准匹配，实现持续的促生作用。
结合EEM光谱和非靶向代谢组学技术，全面解析了微藻-细菌共生体系中的物质交换网络：明确了细菌利用小球藻分泌的31种芳香蛋白类物质，代谢产生136种包括腐殖酸类、富里酸类和植物生长素（IAA）在内的促生物质。
证实了革兰氏阴性细菌（气单胞菌属）比革兰氏阳性细菌（微杆菌属、芽孢杆菌属）更易产生腐殖酸类物质，对小球藻的促生效果更显著，为后续高效促生菌的筛选提供了方向。
6.可延伸的方向
优化微藻-细菌共培养的工艺参数，包括CO₂浓度、温度、光照强度、初始接种比例和通气速率等，建立适合工业化应用的最佳培养体系。
探究三株促生细菌的协同作用机制，构建多菌株复合菌剂，进一步提高小球藻的碳固定效率和系统抗逆性。
深入研究细菌产生的IAA、维生素B₁₂等关键促生物质的合成途径，通过基因工程手段强化这些物质的表达，构建高效工程菌株。
将微藻-细菌共生固碳系统与工业废水处理相结合，利用废水中的氮、磷等营养物质支持微藻和细菌生长，实现碳减排与污染物去除的协同效应。
评估该系统在户外大规模开放池塘和封闭式光生物反应器中的长期运行稳定性和经济性，开发配套的收获和生物质利用技术。
研究高CO₂胁迫下微藻-细菌共生系统的群落演替规律，建立动态调控模型，保障系统的长期高效运行。
7.测量的数据及其研究意义
人工微藻-细菌系统中细菌群落结构数据（图1）：包括门水平和属水平的相对丰度分布，以及基于属水平代表性序列构建的系统发育树。数据显示变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌门，中慢生根瘤菌属占比最高。该数据揭示了高CO₂胁迫下与小球藻共生的核心细菌类群，为后续定向筛选促生细菌提供了明确的方向。
三株分离细菌的形态学和生长动力学数据（图2）：包括固体培养基上的菌落形态、革兰氏染色结果，以及使用Bioscreen仪器测定的72小时OD₆₀₀生长曲线。数据显示GS-H02（微杆菌属）延迟期最短（0-2h），GS-F03（芽孢杆菌属）延迟期最长（0-14h），三株菌的对数生长期均超过24h，稳定期持续至72h无衰亡。该数据证明了长期高CO₂驯化使细菌获得了更长的生长周期，能够与小球藻的生长节奏更好地匹配。
三株细菌的16S rDNA系统发育树数据（图3）：显示GS-H02与氧化微杆菌（Microbacterium oxydans）亲缘关系最近（58%），GS-HL01与气单胞菌属（Aeromonas sp.）亲缘关系最近（91%），GS-F03与芽孢杆菌属（Bacillus sp.）亲缘关系最近（87%）。该数据完成了三株促生细菌的分类学鉴定，为后续研究其生物学特性和作用机制奠定了基础。
微藻-细菌共培养体系的生物量和CO₂固定速率数据（图4）：包括13天培养过程中各组的生物量变化曲线和单日CO₂固定速率。数据显示GS-HL01+小球藻组最终生物量比对照组高24%，第7天单日CO₂固定速率比对照组高245%。该数据直接定量证明了三株细菌均能显著促进小球藻的生长和碳固定，为其应用价值提供了核心证据。
共培养体系胞外有机物的EEM光谱数据（图5）：包括四个实验组和对照组的激发-发射矩阵光谱，分为A（酪氨酸、类蛋白、色氨酸类物质）、B（腐殖酸类）、C（腐殖酸类、富里酸类、疏水酸）、D（芳香蛋白）四个特征区域。数据显示实验组在B、C区域的荧光强度显著高于对照组，而D区域几乎无荧光。该数据直观地证明了细菌利用小球藻分泌的芳香蛋白，产生了腐殖酸类等促生物质。
共培养体系胞外代谢物的差异分析数据（图6）：包括各组代谢物数量的柱状图和代谢物交集的Upset图。数据显示对照组有732种代谢物，三个实验组分别有859、870、875种代谢物，其中31种小球藻特有的代谢物被细菌利用，细菌产生了136种新的代谢物。该数据从代谢组学层面全面揭示了微藻与细菌之间的物质交换过程，为阐明促生机制提供了分子水平的证据。
8.结论
本研究成功构建了15%高浓度CO₂胁迫下的普通小球藻HL 01-细菌共生系统，通过120天的长期驯化和筛选，获得了三株能显著促进小球藻碳固定的细菌，分别为微杆菌属（GS-H02）、芽孢杆菌属（GS-F03）和气单胞菌属（GS-HL01）。其中气单胞菌属菌株的促生效果最为显著，使小球藻最终生物量提高约24%，第7天单日碳固定效率提高约245%。研究发现，经过高CO₂胁迫驯化的细菌具有显著延长的对数生长期和稳定期，能够更好地适应小球藻的生长周期，实现持续的共生互作。通过EEM光谱和LC-MS代谢组学分析证实，微藻与细菌之间存在广泛的物质交换：细菌利用小球藻分泌的芳香蛋白类等31种有机物质作为碳源和氮源，代谢产生腐殖酸类、富里酸类、疏水酸以及植物生长素（IAA）等136种新的有机物质，这些物质能够促进小球藻的光合作用和生长，维持其在营养限制条件下的活力，从而显著提高小球藻的碳固定效率和系统稳定性。本研究为微藻-细菌协同固碳技术的发展提供了新的思路和优质菌种资源，在工业烟气CO₂减排和全球变暖缓解方面具有重要的应用前景。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen FP-1100-C全自动生长曲线分析仪测定了三株分离细菌在LB液体培养基中的生长曲线（图2d），每30秒自动测定一次OD₆₀₀值，持续监测72小时。该仪器测量的生长曲线数据具有以下关键研究意义：
精确揭示细菌的适应性进化特征：Bioscreen仪器的高频率连续读数功能生成了完整的生长动力学曲线，精确计算出各菌株的延迟期、对数生长期和稳定期时长。本研究通过该数据首次发现，经过120天高CO₂胁迫驯化的三株细菌与普通环境分离的细菌相比，对数生长期从通常的数小时延长至24-38小时，稳定期持续至72小时无明显衰亡。这一结果表明细菌在长期高CO₂共生环境中发生了适应性进化，通过调整生长周期来匹配小球藻较慢的生长节奏，从而能够在小球藻的整个生长周期内保持活性，持续发挥促生作用。
筛选与微藻生长周期匹配的最优共生菌株：小球藻的对数生长期通常为7-10天，而普通细菌生长迅速，容易在微藻进入快速生长期之前就进入衰亡期，无法持续提供促生物质。Bioscreen生长曲线数据能够帮助研究者快速筛选出具有长生长周期的细菌菌株。本研究中筛选出的三株细菌均具有超过24小时的对数生长期和长达72小时的稳定期，能够与小球藻的生长周期同步，这是它们能够显著促进小球藻碳固定的核心原因之一。
为共培养体系的工艺优化提供科学依据：通过Bioscreen生长曲线可以准确掌握各菌株的生长阶段和生长速率，从而确定最佳的接种时间和接种比例。例如，本研究中GS-F03（芽孢杆菌属）的延迟期长达14小时，因此在共培养时需要提前12-14小时接种该菌株，使其在小球藻进入对数生长期时也处于活跃的代谢状态，能够及时利用小球藻分泌的胞外有机物并产生促生物质。这一优化策略可以最大限度地发挥微藻与细菌的协同作用，提高固碳效率。
评估细菌对高CO₂胁迫环境的耐受性：Bioscreen仪器可以在不同CO₂浓度、温度、pH等条件下测定细菌的生长曲线，定量评估其对胁迫环境的适应性。本研究中分离的三株细菌能够在以15% CO₂为唯一碳源的寡营养环境中生长，且生长周期显著延长，表明它们已经完全适应了高CO₂胁迫的共生环境。这一特性对于该技术在工业烟气处理中的应用至关重要，因为工业烟气中通常含有10-15%的CO₂，普通细菌难以在这种高浓度CO₂环境中存活和发挥作用。
为后续分子机制研究提供基础数据：生长曲线数据反映了细菌的整体生理状态，结合不同生长阶段的转录组学和代谢组学分析，可以深入研究细菌在高CO₂胁迫下的代谢调控机制和与微藻互作的分子基础。例如，可以在细菌的对数生长期中期和稳定期分别取样，分析其基因表达和代谢物的变化，找出与IAA、腐殖酸等促生物质合成相关的关键基因和代谢途径，为通过基因工程手段进一步提高细菌的促生能力提供靶点。