A cytochrome bd repressed by a MarR family regulator confers resistance to metals, nitric oxide, sulfide, and cyanide in Chromobacterium violaceum
被MarR家族调控因子抑制的细胞色素bd在紫色色杆菌中赋予对金属、一氧化氮、硫化物和氰化物的抗性
来源：February 2025 Volume 91 Issue 2 10.1128/aem.02360-24
1.摘要
紫色色杆菌是一种普遍存在的环境病原体，尽管其适应性极强，但对其胁迫抗性机制知之甚少。本研究在筛选铁敏感转座子突变体时，鉴定出一种细胞色素bd（CioAB）可保护紫色色杆菌抵御多种胁迫。该细胞色素bd的两个亚基由cioRAB操纵子编码，该操纵子还编码GbsR型MarR家族转录因子CioR。∆cioAB突变株对铁和需铁抗生素链黑菌素敏感，且铁载体产量下降。生长曲线和存活实验显示，∆cioAB菌株还对锌、过氧化氢、一氧化氮、硫化物和氰化物敏感。表达分析表明，∆cioR突变株中cioRAB操纵子的启动子活性和cioAB基因的转录水平升高。CioR在体外可结合cio操纵子的启动子区域，表明CioR是其自身操纵子的直接阻遏物。cio操纵子的表达在高细胞密度时增加，且依赖于群体感应调控因子CviR。由于氰化物也是cio表达的信号，且已知内源性氰化物的产生是紫色色杆菌中受群体感应调控的性状，因此研究人员认为CioAB是一种氰化物不敏感的末端氧化酶，可在产氰生长条件下进行呼吸作用。研究结果表明，细胞色素bd CioAB可保护紫色色杆菌抵御多种可能由内源性产生或在与宿主相互作用过程中产生的胁迫因子。
2.关键词（中文）
MarR转录因子、细胞色素bd、紫色色杆菌、氧化和亚硝化应激、金属毒性
3.研究目的
探究紫色色杆菌中胁迫抗性的分子机制，重点解析其对铁毒性的耐受机制。
鉴定紫色色杆菌基因组中唯一编码的细胞色素bd（CioAB）的生物学功能，明确其在多种环境和宿主来源胁迫抗性中的作用。
阐明cioRAB操纵子的转录调控网络，包括MarR家族GbsR型调控因子CioR的直接调控作用，以及群体感应系统和氰化物信号的调控机制。
揭示紫色色杆菌如何避免自身产生的内源性氰化物的自毒作用，建立氰化物产生与抗性之间的关联。
4.研究思路
首先通过筛选紫色色杆菌10000株转座子突变体文库，获得在高铁条件下生长受损的突变株，经测序鉴定转座子插入位点位于编码MarR家族转录因子的cioR基因。随后构建∆cioR和∆cioAB无义缺失突变株及相应的互补菌株，通过平板抗性实验、生长曲线测定、存活实验和纸片扩散实验，系统检测突变株对铁、锌、过氧化氢、一氧化氮、硫化物和氰化物等多种胁迫因子的敏感性。通过RT-PCR验证cioR、cioA、cioB三个基因的共转录关系，确定cioRAB操纵子的结构。利用启动子-lacZ融合报告系统结合β-半乳糖苷酶实验、RT-qPCR和凝胶迁移实验（EMSA），分析CioR对cioRAB操纵子的直接阻遏作用，以及群体感应调控因子CviR和氰化物对该操纵子表达的影响。最后通过体外EMSA实验探究CioR对不同胁迫因子的感应机制，结合已有研究提出CioAB的胁迫保护机制和完整的调控模型。
5.研究亮点
首次在紫色色杆菌中鉴定出唯一的细胞色素bd CioAB，并证实其具有广谱胁迫保护功能，可同时赋予细菌对铁、锌、过氧化氢、一氧化氮、硫化物和氰化物的抗性，这些胁迫因子大多是细菌呼吸链中血红素-铜氧化酶（HCO）的强效抑制剂。
揭示了cioRAB操纵子的双重调控机制：受MarR家族GbsR型调控因子CioR的直接阻遏，同时受群体感应调控因子CviR的激活，且氰化物可通过间接机制诱导该操纵子表达。
发现CioR并非直接的氰化物传感器，而是通过感应细胞内游离铁和锌离子的水平来调控操纵子表达；氰化物通过抑制细胞内金属酶，间接增加游离金属离子浓度，从而解除CioR的阻遏作用。
建立了紫色色杆菌中群体感应调控的氰化物产生与CioAB介导的氰化物抗性之间的时空关联，解释了该菌在高细胞密度时大量产生氰化物却不会自毒的分子机制。
6.可延伸的方向
进一步探究CioAB在紫色色杆菌宿主感染过程中的作用，特别是其对宿主巨噬细胞产生的一氧化氮的抗性是否与细菌的毒力和胞内存活能力相关。
解析CioR与铁、锌离子结合的具体结构基础，明确其金属感应的分子机制和构象变化过程。
研究群体感应调控因子CviR激活cioRAB操纵子的具体分子机制，确定CviR是否直接结合该操纵子的启动子区域，还是通过其他调控级联间接发挥作用。
探究CioAB与紫色色杆菌中其他呼吸末端氧化酶之间的功能互补关系，以及在不同氧浓度、营养条件和胁迫环境下的表达调控网络。
以CioAB为特异性靶点，开发针对紫色色杆菌及其他产氰致病菌的新型抗菌药物，解决传统抗生素的耐药性问题。
7.测量的数据及其研究意义
铁敏感性平板实验数据（图2A）：显示∆cioAB突变株在含5 mM FeCl₃或8 mM FeSO₄的LB平板上无法生长，而∆cioR突变株和野生型菌株生长正常，互补菌株可恢复生长，直接证明CioAB是紫色色杆菌耐受铁毒性所必需的。
不同胁迫条件下的生长曲线数据（图2B、C、E、F、G；图3A-F）：使用Bioscreen C或BioTek Epoch2酶标仪测定了各菌株在LB培养基及添加多种胁迫因子条件下的OD₆₀₀随时间的变化，定量证明了∆cioAB突变株对铁、链黑菌素、锌、过氧化氢、一氧化氮、硫化物和氰化物的敏感性，互补菌株可恢复抗性，验证了CioAB的广谱胁迫保护功能。
铁载体产量数据（图2D）：通过PSA-CAS平板实验测定了各菌株的铁载体产生量，显示∆cioAB突变株的铁载体产量显著低于野生型和互补菌株，提示CioAB缺失可能导致细胞内游离Fe(II)水平升高，进而通过Fur介导的阻遏作用抑制铁载体合成。
存活实验和纸片扩散实验数据（图S1A、B）：验证了∆cioAB突变株对FeCl₃、链黑菌素、ZnCl₂和H₂O₂的敏感性，与生长曲线结果一致，提供了更直接的细菌存活数据。
氰化物耐受性实验数据（图S1C）：测定了野生型紫色色杆菌对不同浓度KCN的耐受性，显示其可在毫摩尔级浓度的外源氰化物中生长，证明该菌具有极强的氰化物抗性。
大体积培养生长曲线数据（图S1D）：显示∆cioAB突变株在无外源胁迫的LB培养基中，进入稳定期后细胞密度显著低于野生型，提示CioAB可能参与抵御细菌自身产生的内源性氰化物的毒性。
RT-PCR共转录实验数据（图1C）：扩增得到了cioR-cioA（645 bp）和cioR-cioB（1528 bp）之间的预期大小的DNA片段，证明cioR、cioA、cioB三个基因共转录，形成cioRAB操纵子。
β-半乳糖苷酶实验数据（图4A；图5A、B）：测定了cioRAB启动子-lacZ融合在不同细胞密度、不同突变背景及不同胁迫因子处理下的β-半乳糖苷酶活性，表明cioRAB操纵子的表达在高细胞密度时上调，受CioR阻遏和CviR激活，且仅氰化物可诱导其表达。
RT-qPCR数据（图4B）：定量测定了野生型、∆cioR和互补菌株中cioA和cioB基因的转录水平，显示∆cioR突变株中这两个基因的表达显著升高，进一步证实CioR对cioAB的阻遏作用。
凝胶迁移实验（EMSA）数据（图4C；图5C-F）：证明纯化的His-CioR蛋白可特异性结合cioRAB操纵子的启动子区域；100 µM的铁或锌离子可破坏CioR与DNA的结合，且这种作用可被金属螯合剂EDTA逆转，但不能被还原剂DTT逆转，表明CioR通过结合金属离子而失活，且不涉及半胱氨酸的氧化。
8.结论
紫色色杆菌中的细胞色素bd CioAB由cioRAB操纵子编码，该操纵子还编码GbsR型MarR家族转录因子CioR，三个基因共转录形成一个完整的转录单元。
CioAB是紫色色杆菌耐受铁、锌、过氧化氢、一氧化氮、硫化物和氰化物等多种胁迫因子所必需的，其保护机制主要是由于CioAB对这些抑制血红素-铜氧化酶的胁迫因子不敏感，同时其自身的过氧化氢酶活性可直接分解过氧化氢，抵御氧化应激。
CioR是cioRAB操纵子的直接阻遏物，可通过结合启动子区域抑制其表达；细胞内游离的铁和锌离子可直接结合CioR使其构象发生改变，从而解除对操纵子的阻遏作用。
cioRAB操纵子的表达受群体感应调控因子CviR的激活，在高细胞密度时表达上调，与紫色色杆菌在高细胞密度时通过群体感应系统大量产生内源性氰化物的特性相匹配。
氰化物并非直接作用于CioR，而是通过抑制细胞内含有金属辅基的酶类，间接增加细胞内游离铁和锌离子的浓度，进而解除CioR的阻遏作用，诱导cioRAB操纵子表达。
CioAB作为氰化物不敏感的末端氧化酶，是紫色色杆菌抵御自身产生的内源性氰化物毒性的关键机制，可能在该菌的种间竞争、捕食逃避和宿主感染过程中发挥重要作用。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定了紫色色杆菌野生型、∆cioR突变株、∆cioAB突变株及相应互补菌株在多种胁迫条件下的生长动力学，该仪器可同时测定100个样品的OD₆₀₀值，每60分钟自动读数一次，实现了高通量、自动化的细菌生长监测，其测量数据的研究意义主要体现在以下几个方面：
定量验证CioAB的广谱胁迫保护功能：Bioscreen仪器生成的连续生长曲线（图2B、C、E、F、G；图3A-F）提供了细菌在不同胁迫条件下的延迟期、对数生长期斜率和最大生物量等精确的定量参数。例如，在添加5 mM FeCl₃的条件下（图2B），∆cioAB突变株的生长几乎完全被抑制，而野生型和互补菌株可正常生长；在添加250 µM KCN的条件下（图3E），∆cioAB突变株的生长速率显著降低，最大OD₆₀₀仅为野生型的约10%。这些定量数据直观且准确地证明了CioAB缺失导致细菌对多种胁迫因子的敏感性显著增加，而互补菌株可完全恢复生长表型，为CioAB的胁迫保护功能提供了最直接、最可靠的实验证据。
区分不同胁迫因子的作用强度和作用模式：通过比较不同胁迫条件下的生长曲线，可以分析各胁迫因子对细菌生长的影响程度和作用阶段。例如，一氧化氮（SperNO）处理（图3C）主要抑制细菌的对数生长期，对延迟期影响较小；而氰化物（KCN）处理（图3E）则同时显著延长延迟期和降低对数生长期斜率，且抑制作用更强。这种差异反映了不同胁迫因子对细菌呼吸链和代谢过程的不同作用机制，也提示CioAB在抵御不同胁迫时可能存在不同的贡献程度和作用方式。
揭示CioAB在正常生长条件下的生理功能：在无外源胁迫的LB培养基中，使用Bioscreen仪器测定的微板培养生长曲线显示∆cioAB突变株与野生型菌株的生长无显著差异（图2和图3中的连续实线），但在大体积玻璃管培养中（图S1D），∆cioAB突变株在稳定期的细胞密度显著低于野生型。这一结果提示，在微板培养的高通气条件下，细菌产生的内源性氰化物易挥发，培养基中浓度较低，因此对生长的影响不明显；而在大体积培养的低通气条件下，内源性氰化物在培养基中积累，此时CioAB的缺失导致细菌无法进行正常的呼吸作用，生长受到显著抑制。这一发现为CioAB参与抵御内源性氰化物自毒作用提供了关键的实验证据。
验证铁在链黑菌素毒性中的核心作用：通过测定∆cioAB突变株在添加不同浓度铁螯合剂2,2'-联吡啶（DP）的链黑菌素处理条件下的生长曲线（图2F、G），发现随着DP浓度的增加，突变株的生长得到部分恢复。这一结果表明，链黑菌素的杀菌活性部分依赖于细胞内的游离铁，而CioAB缺失导致的游离Fe(II)水平升高加剧了链黑菌素介导的氧化损伤和DNA破坏，为解释∆cioAB突变株对链黑菌素的高敏感性提供了直接的实验依据。
为后续机制研究提供标准化的基础数据：Bioscreen生长曲线的定量数据为进一步研究CioAB的作用机制和调控网络提供了标准化的表型数据。例如，通过比较不同调控因子突变株在相同胁迫条件下的生长曲线，可以分析各调控因子对CioAB表达的影响程度；通过测定不同浓度胁迫因子下的生长曲线，可以计算各菌株的半数抑制浓度（IC₅₀），定量评估CioAB对不同胁迫因子的保护效率，为后续的分子机制研究和抗菌药物开发提供重要的参考依据。