Evaluation and validation of extensive growth and growth boundary models for mesophilic and psychrotolerant Bacillus cereus in dairy products (Part 2)
乳制品中嗜温性和耐冷性蜡样芽孢杆菌广泛生长及生长边界模型的评估与验证（第二部分）
来源：Front. Microbiol. 16:1553903.
1.摘要
本研究评估了两个整合11种环境因素及其相互作用的嗜温性和耐冷性蜡样芽孢杆菌生长及生长边界预测模型。通过66个嗜温菌株和67个耐冷菌株的新挑战试验，以及文献中139个嗜温菌株和109个耐冷菌株的生长响应数据，系统验证了模型性能，并与8种现有模型进行对比。结果显示，新嗜温模型无需校准即可表现优异，新挑战试验和文献数据的偏差/准确因子分别为1.13/1.49和0.97/1.36，生长/不生长预测准确率分别为80%和91%，失败危险预测率仅为3%和0%。耐冷模型经μopt校准后在新挑战试验中表现良好，但在<10℃低温下预测不足，通过扩展温度项（1-10℃）后性能显著提升，偏差/准确因子达到1.07/1.80，预测准确率91%且无失败危险预测。两个新模型通过纳入更多环境因素及其相互作用，显著优于现有模型，可广泛应用于乳制品中蜡样芽孢杆菌的生长管理、风险评估及产品配方优化。
2.关键词（中文）
预测建模、模型验证、产品配方、微生物风险评估、食品安全
3.研究目的
一是验证Maktabdar等人（2025，第一部分）基于实验室培养基开发的嗜温和耐冷蜡样芽孢杆菌生长及生长边界模型在真实乳制品基质中的适用性；二是确定模型在不同乳制品类型、产品特性和储存温度下的适用范围；三是系统比较新模型与8种现有主流蜡样芽孢杆菌生长模型的预测性能，明确其优势与不足；四是修正耐冷模型在低温（<10℃）下的预测偏差，提升其对冷藏乳制品的适用性；五是为乳制品企业提供可靠的微生物生长预测工具，支持产品开发、安全货架期估算和食品安全风险管理。
4.研究思路
研究分为五个核心阶段：第一阶段，制备涵盖商业乳制品（布里干酪、马斯卡彭奶酪、牛奶等9种）、定制乳制品（加工奶酪、印度奶酪等）和乳成分溶液（乳清、乳清蛋白浓缩物等）的123个样品，全面表征其pH、水分活度、有机酸、磷酸盐等关键特性；第二阶段，接种由6株嗜温和7株耐冷致病性蜡样芽孢杆菌组成的混合菌株，在3-39℃范围内进行挑战试验，通过平板计数测定生长动力学参数（最大比生长速率μmax、滞后时间tlag、最大菌数Nmax）；第三阶段，系统收集已发表文献中乳制品内蜡样芽孢杆菌的生长数据，提取371个生长响应，构建包含50株不同菌株的综合验证数据集；第四阶段，采用偏差因子（Bf）、准确因子（Af）和生长/不生长预测准确率评估模型性能，与现有8种模型对比，并针对耐冷模型的低温缺陷修正其温度项；第五阶段，确定模型的精确适用范围，提出实际应用建议（如推荐的相对滞后时间、安全ψ值阈值）。
5.研究亮点
一是构建了目前最全面的蜡样芽孢杆菌生长预测模型，首次整合了温度、pH、水分活度、5种有机酸（乙酸、苯甲酸、柠檬酸、乳酸、山梨酸）和3种磷酸盐（正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸）共11种环境因素及其相互作用，解决了现有模型因素单一、无法准确预测复杂乳制品的问题；二是采用了规模空前的多基质验证数据集，涵盖29种商业乳制品、定制奶酪和乳成分溶液，验证范围覆盖了绝大多数市售乳制品类型，结果具有广泛的代表性；三是首次系统对比了8种现有模型在乳制品中的性能，明确了现有模型因忽略有机酸和磷酸盐的抑制作用而导致过高的失败安全预测率（24-26%），证明了多因素模型的必要性；四是创新性地修正了耐冷模型的低温温度项，通过引入分段温度函数，成功解决了原模型在1-10℃下的预测不足问题，使其适用于冷藏乳制品；五是提供了明确的模型应用参数，确定了推荐的相对滞后时间（嗜温6.1、耐冷4.2）和安全ψ值阈值（≥2.0可完全抑制生长），为企业实际应用提供了可直接操作的指导。
6.可延伸方向
一是评估模型在动态温度波动和产品特性变化（如奶酪成熟过程中pH和乳酸浓度变化）条件下的预测性能；二是扩展模型以纳入更多生长抑制因素，如二氧化碳、氧气、乳酸链球菌素（nisin）以及乳酸菌的拮抗作用；三是验证模型在肉类、谷物、蔬菜等其他食品类别中的适用性，扩大其应用范围；四是优化滞后时间的预测模型，考虑热加工、孢子萌发等因素对滞后时间的影响，提高其预测准确性；五是开发针对产呕吐毒素、肠毒素等特定致病性蜡样芽孢杆菌菌株的专用预测模型；六是将模型集成到食品企业的质量管理系统和冷链监控平台，实现实时微生物风险预警和货架期动态调整。
7.测量的数据及研究意义
测定了新挑战试验中各类乳制品和乳成分溶液的产品特性及蜡样芽孢杆菌生长动力学数据，数据来自表1和表2。意义：提供了不同基质、不同环境条件下蜡样芽孢杆菌的基础生长数据，涵盖了广泛的产品特性范围，为模型校准和验证提供了核心依据。
测定了文献中嗜温性蜡样芽孢杆菌在各类乳制品中的生长特性数据，数据来自表3。意义：扩大了验证数据集的范围，涵盖了24株不同的嗜温菌株，验证了模型对不同菌株的通用性。
测定了文献中耐冷性蜡样芽孢杆菌在各类乳制品中的生长特性数据，数据来自表4。意义：提供了低温条件下耐冷菌株的生长数据，为修正耐冷模型的低温性能提供了关键参考。
测定了文献中未明确分类的蜡样芽孢杆菌在各类乳制品中的生长特性数据，数据来自表5。意义：进一步丰富了验证数据集，测试了模型对未知类型菌株的预测能力。
测定了新嗜温模型与4种现有模型的性能对比数据，数据来自表6。意义：量化了新模型与现有模型的性能差异，证明了新模型在预测准确性和安全性方面的显著优势。
测定了新耐冷模型与4种现有模型的性能对比数据，数据来自表7。意义：明确了原耐冷模型的低温缺陷，验证了修正后模型的性能提升效果。
测定了嗜温性蜡样芽孢杆菌生长速率的观察值与预测值对比数据，数据来自图1。意义：直观展示了新嗜温模型的预测准确性，识别了少数预测偏差的来源（如接近生长边界的条件）。
测定了修正后耐冷性蜡样芽孢杆菌生长速率的观察值与预测值对比数据，数据来自图2。意义：直观验证了温度项修正后耐冷模型在低温下的预测性能显著提升。
测定了修正后耐冷模型的温度响应曲线数据，数据来自图3。意义：展示了分段温度函数的形状，明确了模型在1-10℃和10-40℃范围内的温度响应特性。
测定了新挑战试验中相对滞后时间（RLT）和最大菌数（Nmax）数据，数据来自补充表S1。意义：为模型中滞后时间的应用提供了依据，明确了温度对最大菌数的影响规律。
测定了文献中相对滞后时间（RLT）数据，数据来自补充表S2。意义：验证了新挑战试验中RLT数据的代表性，为推荐平均RLT值提供了支持。
8.结论
本研究成功验证了两个广泛的嗜温性和耐冷性蜡样芽孢杆菌生长及生长边界预测模型，确定了其在乳制品中的适用范围。新模型能够准确预测不同类型乳制品、广泛产品特性和储存温度下的蜡样芽孢杆菌生长响应，总失败危险预测率仅为0.8%，远低于食品安全可接受阈值（5%）。修正后的耐冷模型解决了原模型在1-10℃低温下的预测不足问题，适用于冷藏乳制品。两个新模型通过纳入更多环境因素及其相互作用，显著优于现有模型，能够更准确地预测复杂乳制品中的微生物生长。模型可用于乳制品的产品开发与配方优化、微生物风险评估以及安全货架期估算，推荐使用平均相对滞后时间6.1（嗜温模型）和4.2（耐冷模型），当ψ值≥2.0时可有效抑制蜡样芽孢杆菌生长。为方便应用，模型将集成到用户友好的食品腐败与安全预测器（FSSP）软件中。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中，芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪主要用于第一部分模型开发阶段，在BHI肉汤和1.45% UF乳清渗透液中测定了嗜温和耐冷蜡样芽孢杆菌混合菌株在不同环境条件下的生长动力学。这些生长曲线数据对本研究的核心意义体现在以下几个方面：
为模型开发提供了基础动力学参数：Bioscreen的高通量和自动化特性，使得能够同时测定数百个样品在不同温度、pH、盐浓度、有机酸和磷酸盐条件下的生长曲线，每小时自动测定一次OD600值，连续监测48小时。基于这些精确的生长曲线，计算得到了模型所需的核心参数，包括最适生长速率（μopt）、最低/最适/最高生长温度（Tmin/Topt/Tmax）、最低pH、最低水分活度以及各种抑制剂的半抑制浓度等。没有这些高精度的基础动力学数据，就无法构建出包含11种环境因素及其相互作用的复杂预测模型。
验证了乳基质对细菌生长的影响：通过对比BHI肉汤和UF乳清渗透液中的生长速率，发现两者在相同环境条件下无显著差异（p>0.05），但部分 cardinal 参数（如pH和有机酸的抑制常数）存在差异。这一发现为模型中引入乳基质特异性的 cardinal 参数提供了直接依据，显著提高了模型在乳制品中的预测准确性。如果仅使用BHI肉汤的数据开发模型，会导致在乳制品中的预测出现显著偏差。
为模型校准提供了基准参照：Bioscreen测定的纯培养生长速率是评估乳制品挑战试验中生长速率的基准。通过对比纯培养和乳制品中的生长速率，发现耐冷模型在乳制品中的生长速率被低估，从而确定需要对μopt进行校准（从2.12 h⁻¹校准至2.67 h⁻¹）。这一校准是耐冷模型能够准确预测乳制品中生长的关键步骤。
确保了模型参数的可靠性和可重复性：Bioscreen的全自动化操作消除了人工取样带来的误差，保证了所有样品在完全一致的温度、振荡和通气条件下培养。每个条件设置多个生物学重复和技术重复，使得测定的生长动力学参数具有高度的可靠性和可重复性，为模型的稳定性和准确性奠定了基础。
支持了多因素相互作用的建模：传统的试管培养方法难以同时研究多个因素的交互作用，而Bioscreen的100孔通量设计使得能够采用全因子或部分因子实验设计，系统研究11种环境因素之间的协同和拮抗作用。本研究中模型的交互项（ξ）就是基于这些多因素生长曲线数据拟合得到的，这是现有单因素或双因素模型无法实现的。