Antibacterial activity of the novel peptide Pac-525 with the RGD motif against intracellular Escherichia coli
具有RGD基序的新型肽Pac-525对细胞内大肠杆菌的抗菌活性
来源：Scientific Reports | (2025) 15:19995
1.摘要
侵袭性细胞内细菌引起的感染因病原体可在宿主细胞内存活增殖、传统抗生素难以进入细胞内发挥作用而成为重大治疗挑战。本研究合成了带有RGD结构域的抗菌肽Pac-525（RGD-Pac525），以增强其对真核细胞的穿透能力。通过RAW 264.7巨噬细胞系、鸡肠道类器官和鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）三种模型，系统评估了RGD-Pac525的抗细胞内感染效果和安全性。结果表明，RGD-Pac525保留了原始肽的抗菌活性，在巨噬细胞中可将细胞内粘附侵袭性大肠杆菌KV203减少50%，且不影响巨噬细胞活力；在鸡肠道类器官中能有效降低胞内细菌负荷，同时不破坏类器官结构完整性；在鸡胚体内实验中，可显著减少肝脏和肠道组织中的细菌载量，实现全身分布并克服组织屏障。该研究为利用RGD修饰抗菌肽治疗细胞内细菌感染提供了有力的概念验证。
2.关键词（中文）
细胞内感染、抗菌肽、RGD-Pac525、类器官、鸡胚绒毛尿囊膜实验
3.研究目的
一是解决传统抗生素细胞穿透性差、对细胞内细菌感染疗效有限的临床难题，开发能有效进入真核细胞的新型抗菌剂；二是验证RGD细胞穿透基序与抗菌肽Pac-525的融合策略，在保留抗菌活性的同时赋予其细胞内化能力；三是通过体外细胞模型、3D生理类器官和体内鸡胚模型的多层次验证，系统评估RGD-Pac525的抗细胞内大肠杆菌活性、生物相容性和组织分布特性；四是探索RGD-Pac525在治疗系统性细胞内细菌感染中的应用潜力，为后续药物开发奠定基础。
4.研究思路
研究分为六个递进阶段：第一阶段，合成高纯度的RGD-Pac525、原始Pac-525和单独RGD肽作为对照；第二阶段，利用Bioscreen C MBR系统测定三种肽对浮游大肠杆菌KV203的生长抑制作用，计算最小抑菌浓度（MIC）和半最大抑菌浓度（MIC₅₀），评估RGD修饰对抗菌活性的影响；第三阶段，通过MTT法检测三种肽对RAW 264.7巨噬细胞的细胞毒性，确定安全用药浓度范围；第四阶段，采用罗丹明B荧光标记肽，通过共聚焦显微镜观察肽的细胞穿透能力，并利用庆大霉素保护实验定量检测对细胞内大肠杆菌的清除效果；第五阶段，构建鸡肠道3D类器官感染模型，评估RGD-Pac525对类器官内细菌侵袭和增殖的抑制作用；第六阶段，通过鸡胚CAM感染模型，检测肽的体内抗菌活性、对胚胎存活率的影响以及在脑、肝、肠等组织中的分布和杀菌效果；最后综合所有数据，评价RGD-Pac525的有效性和安全性。
5.研究亮点
一是创新性地将RGD细胞穿透基序与抗菌肽Pac-525融合，成功解决了传统抗菌肽难以进入真核细胞的瓶颈，实现了抗菌肽的细胞内靶向递送，且无需额外的释放触发条件，简化了应用流程；二是采用了从体外到体内的多层次验证体系，涵盖了细胞系、3D类器官和鸡胚模型，既保证了实验的高通量和可重复性，又提高了结果的生理相关性，为临床转化提供了更可靠的依据；三是首次证实了Pac-525在细胞内细菌感染治疗中的应用价值，拓展了该广谱抗菌肽的临床应用场景，为治疗克罗恩病等与粘附侵袭性大肠杆菌相关的疾病提供了新候选；四是发现RGD-Pac525具有双重治疗潜力，不仅能直接杀灭细胞内细菌，还能抑制感染诱导的血管生成，可能通过调节宿主免疫反应辅助治疗感染。
6.可延伸方向
一是优化RGD-Pac525的分子结构，如采用环状RGD、引入柔性连接臂或进行D型氨基酸修饰，进一步提高其细胞穿透效率、抗菌活性和体内稳定性；二是扩大抗菌谱评估，测试RGD-Pac525对沙门氏菌、李斯特菌、结核分枝杆菌等其他重要细胞内致病菌的抗菌活性；三是开展哺乳动物体内实验，建立小鼠系统性感染模型，研究RGD-Pac525的药代动力学、组织分布、长期毒性和治疗效果；四是探索联合用药策略，评估RGD-Pac525与传统抗生素（如氟喹诺酮类、β-内酰胺类）的协同抗菌作用，降低用药剂量并减少耐药性产生；五是开发纳米制剂递送系统，如脂质体、聚合物纳米粒等，提高RGD-Pac525的生物利用度和靶向性；六是深入研究作用机制，解析RGD-Pac525与细菌细胞膜和真核细胞整合素受体的相互作用，以及其在细胞内的杀菌途径。
7.测量的数据及研究意义
测定了不同浓度RGD、Pac525和RGD-Pac525处理下大肠杆菌KV203的24小时生长曲线数据，数据来自图1a。意义：直观展示了三种肽对浮游细菌生长的动态抑制作用，证实RGD本身无抗菌活性，RGD-Pac525保留了Pac525的抗菌能力，为后续定量分析提供了基础。
测定了24小时后大肠杆菌KV203的相对光密度数据，数据来自图1b。意义：定量计算出Pac525的MIC为62.5 μg/ml、MIC₅₀为41.0 μg/ml，RGD-Pac525的MIC为125.0 μg/ml、MIC₅₀为92.6 μg/ml，明确了两种肽的抗菌效价，为后续细胞和动物实验的浓度选择提供了依据。
测定了不同浓度肽处理下RAW 264.7巨噬细胞的代谢活性数据（MTT法），数据来自图1c。意义：确定了三种肽的细胞毒性阈值，RGD-Pac525的IC₇₀为446.94 μg/ml，显著高于其抗菌浓度，证明在有效杀菌浓度下对宿主细胞无明显毒性，安全性良好。
测定了荧光标记肽在RAW 264.7细胞内的定位成像数据，数据来自图2bA、bC、bE。意义：直观证实RGD-Pac525能有效穿透巨噬细胞膜进入细胞质，而Pac525细胞摄取量极低，RGD仅结合在细胞表面，明确了RGD基序的细胞穿透作用。
测定了细胞内GFP标记大肠杆菌的荧光成像数据，数据来自图2bB、bD、bF。意义：定性显示RGD-Pac525处理后细胞内细菌数量显著减少，而RGD和Pac525处理组无明显变化，直观验证了RGD-Pac525的细胞内抗菌活性。
测定了庆大霉素保护实验中细胞内大肠杆菌的CFU计数数据，数据来自图2c。意义：定量表明RGD-Pac525能将细胞内大肠杆菌数量减少50%（p≤0.001），而RGD和Pac525仅分别减少18.4%和23.6%，精确量化了三种肽的细胞内抗菌效果差异。
测定了鸡肠道类器官的形态学观察数据，数据来自图3a。意义：证实成功构建了具有中央管腔和隐窝样结构的功能性鸡肠道类器官，为研究肠道病原体-宿主相互作用提供了生理相关性更高的3D模型。
测定了RGD-Pac525处理后类器官培养基中GFP标记大肠杆菌的荧光强度数据，数据来自图3b、c。意义：定量显示RGD-Pac525能减少85%的胞外细菌，同时抑制细菌对类器官的侵袭。
测定了类器官内GFP标记大肠杆菌的荧光成像数据，数据来自图3d。意义：直观证实RGD-Pac525能有效清除已侵入类器官内部的大肠杆菌，而未处理组类器官内有大量细菌定植。
测定了鸡胚感染后的存活率和体重数据，数据来自图4a、b。意义：显示RGD-Pac525处理组胚胎死亡率从25%降至0%，但对胚胎体重无显著影响，证明其在体内具有良好的治疗效果和生物相容性。
测定了CAM组织的血管密度定量数据，数据来自图4c、d。意义：发现大肠杆菌感染会诱导CAM血管生成增加20%，而RGD-Pac525处理能抑制这一过程，提示其可能具有抗炎和抗血管生成的辅助治疗作用。
测定了CAM组织中GFP标记大肠杆菌的荧光成像数据，数据来自图4e。意义：直观显示RGD-Pac525能显著减少CAM感染部位的细菌负荷。
测定了鸡胚脑、肝、肠组织中大肠杆菌的CFU计数数据，数据来自图4f。意义：定量表明RGD-Pac525能显著降低肝脏和肠道中的细菌载量（p<0.05），证明其能通过全身分布清除多器官的细胞内感染。
8.结论
本研究成功合成了RGD修饰的新型抗菌肽RGD-Pac525，证实其在保留原始Pac525抗菌活性的同时，获得了高效的真核细胞穿透能力。通过RAW 264.7巨噬细胞、鸡肠道3D类器官和鸡胚CAM模型的系统验证，RGD-Pac525能有效清除细胞内的粘附侵袭性大肠杆菌KV203，且在有效浓度下对宿主细胞和组织无明显毒性。该研究为治疗细胞内细菌感染提供了一种创新的合成生物学策略，RGD-Pac525有望成为治疗克罗恩病、尿路感染等与细胞内大肠杆菌相关疾病的候选药物，也为其他抗菌肽的细胞内递送改造提供了可借鉴的范式。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C MBR全自动微生物生长曲线分析仪，在100孔无菌蜂窝板中进行大肠杆菌KV203的生长抑制实验，培养条件为37℃、连续振荡，每30分钟自动测定一次600 nm处的光密度值，连续监测24小时，每个浓度设置3个生物学重复和3个技术重复（n=9）。这些生长曲线数据的研究意义主要体现在以下几个方面：
实现高通量、标准化的抗菌活性筛选：Bioscreen的100孔通量设计，使得本研究能够在单次实验中同时测定RGD、Pac525和RGD-Pac525三种肽在10个梯度浓度下的抗菌活性，相比传统试管培养和人工取样，筛选效率提升了数十倍。仪器的全自动化操作消除了人为误差，保证了所有样品在完全一致的温度、振荡和通气条件下培养，确保了不同肽、不同浓度之间数据的可比性，为准确评估RGD修饰对抗菌活性的影响提供了标准化的实验平台。
动态捕捉细菌生长的全过程变化：每30分钟一次的高密度OD测定，能够完整记录大肠杆菌从延迟期、对数期到稳定期的整个生长动态。从图1a的生长曲线可以清晰看出，Pac525和RGD-Pac525在浓度≥62.5 μg/ml时完全抑制了细菌的生长，而RGD在所有测试浓度下均无抗菌作用。这种动态监测比传统的24小时终点OD测定更能全面反映抗菌肽的作用模式，能够区分抑菌和杀菌作用，以及观察是否存在延迟生长现象，为后续机制研究提供了重要线索。
精确计算抗菌活性的定量参数：基于连续的生长曲线数据，可以准确计算出最小抑菌浓度（MIC）和半最大抑菌浓度（MIC₅₀）这两个核心抗菌活性参数。本研究中，通过分析图1a和图1b的数据，确定Pac525的MIC为62.5 μg/ml，RGD-Pac525的MIC为125.0 μg/ml，表明RGD修饰虽然使抗菌活性略有下降，但仍保持在有效的范围内。这些定量数据为后续细胞实验和动物实验的浓度选择提供了关键依据，确保了实验浓度的科学性和合理性。
有效排除高浓度样品的光学干扰：在高浓度肽组中，图1b显示相对光密度略有升高，但通过观察对应的生长曲线（图1a）发现这些组实际上没有细菌生长，研究人员据此判断这是由于肽本身的光学性质导致的，而非细菌增殖。这种结合动态生长曲线和终点OD的综合分析方法，能够有效避免高浓度生物大分子对OD测定的干扰，显著提高了抗菌活性评价结果的准确性。
建立细胞内抗菌活性的基准参照：Bioscreen测定的浮游细菌抗菌活性数据，是评估RGD-Pac525细胞内抗菌活性的重要基准。通过比较浮游细菌MIC和细胞内实验的有效浓度，可以判断抗菌肽进入细胞后是否仍能保持其抗菌活性。本研究中，RGD-Pac525在250 μg/ml的浓度下能清除50%的细胞内细菌，该浓度仅为其MIC的2倍，说明其在细胞内的酸性环境中仍能有效发挥抗菌作用，这对于细胞内感染治疗至关重要。
为抗菌肽的结构优化提供方向：通过对比Pac525和RGD-Pac525的生长曲线和MIC值，可以定量评估RGD修饰对抗菌活性的影响程度。本研究结果表明，线性RGD的融合使抗菌活性下降了约2倍，这为后续的结构优化提供了明确的方向，例如可以采用亲和力更高的环状RGD或优化连接臂长度，在保持细胞穿透能力的同时进一步提高抗菌活性。