Toehold Switch-Based Approach for Engineering Acid-Tolerance Modules to Enhance Production Robustness of Industrial E. coli Strains at Low pH
基于脚尖开关的工艺方法，用于设计耐酸模块，以增强工业大肠杆菌株在低pH下生产的稳健性
来源：Microbial Biotechnology, 2025; 18:e70175
1.摘要
提升工业微生物的耐酸性对于提高发酵效率和可持续性至关重要。本研究提出了一种合成生物学方法，采用基于脚尖开关（toehold switch）的耐酸模块来工程化耐酸菌株。该方法构建了由触发块和开关块组成的模块，整合了4种酸响应启动子和18种耐酸基因，生成了约105个构建体的合成模块文库。通过逐步评估，鉴定出两个最优合成模块RE-6和RE-38，使工业赖氨酸生产菌株在pH 5.5下的赖氨酸滴度和得率与亲本菌株在pH 6.8下的水平相当。转录分析显示，参与蛋白质质量控制、活性氧清除和氧化还原稳态的关键耐酸基因的上调，是工程菌株耐酸性增强的主要原因。本研究提供了一种强大的基于脚尖开关的方法，用于构建目标合成模块，尤其适用于提升工业菌株在酸性条件下的稳健性和生产效率。
2.关键词（中文）
耐酸性、赖氨酸生产、逐步评估、合成模块、脚尖开关
3.研究目的
一是开发一种基于脚尖开关的模块化合成生物学策略，实现触发RNA和耐酸基因表达的独立调控，解决传统单一基因过表达耐酸效果有限、难以精细调控的问题；二是构建包含多种耐酸机制基因的大规模合成模块文库，通过高效筛选获得能在更严苛酸性条件（pH 5.5）下发挥作用的耐酸模块，突破此前模块仅在pH 6.0下有效的限制；三是验证最优耐酸模块在工业赖氨酸生产大肠杆菌中的适用性，实现低pH发酵下的稳健生产，降低工业发酵过程中氨和酸的消耗，提高经济性；四是阐明工程菌株耐酸性增强的分子机制，明确关键基因和调控通路，为后续工业微生物的胁迫耐受性改造提供理论依据和新靶点。
4.研究思路
研究分为五个递进阶段：第一阶段，表征9对脚尖开关和4种不同强度的酸响应Pasr启动子，筛选出4对诱导倍数高、基础表达低的触发-开关对，建立酸响应的精准调控框架；第二阶段，采用Golden Gate组装技术分别构建触发块文库（256种组合，4种启动子×4种触发RNA）和开关块文库（300种组合，涵盖4类18种耐酸基因），组合形成理论多样性达7.68×10⁴的合成耐酸模块文库；第三阶段，通过10轮pH 4.5的连续传代压力筛选富集耐酸菌株，再利用Bioscreen C分析仪在pH 5.5下进行两轮高通量生长测定，以最终OD₆₀₀和最大生长速率为指标筛选出优于野生型120%以上的菌株；第四阶段，将最优模块转化到工业赖氨酸生产菌株SCEcL3中，通过BioLector微流控生物反应器进行补料分批发酵，验证其在低pH下的生产性能；第五阶段，采用RT-qPCR分析关键耐酸基因在指数期和稳定期的转录水平，结合模块组成解析耐酸增强的分子机制。
5.研究亮点
一是首次将脚尖开关技术应用于微生物耐酸模块构建，创新性地将模块拆分为独立的触发块和开关块，实现了触发RNA表达水平和耐酸基因表达水平的分别调控，大幅提高了模块设计的灵活性和筛选效率；二是构建了覆盖多种耐酸机制的大规模合成模块文库，整合了质子消耗、蛋白质保护、ROS清除、细胞膜修饰等4类核心耐酸机制的18个基因，通过逐步筛选策略高效获得了在pH 5.5下有效的最优模块，显著提升了耐酸工程的上限；三是成功实现了实验室模块向工业菌株的转化应用，最优模块RE-38使工业赖氨酸生产菌在pH 5.5下的赖氨酸滴度达21.0 g/L、得率0.28 g/g，分别为亲本菌株在pH 6.8下的124%和130%，具有直接的工业应用价值；四是明确了大肠杆菌耐酸性的两个核心调控靶点，发现degP（周质伴侣蛋白）和sthA（可溶性转氢酶）的协同上调是增强耐酸性的关键，为后续耐酸工程提供了新的基因靶点和设计思路。
6.可延伸方向
一是优化脚尖开关的调控性能，引入遗传绝缘子和更强的转录终止子，减少不同表达盒之间的转录通读，提高基因表达调控的精确性和模块的稳定性；二是扩大耐酸基因库，纳入质子泵、细胞膜脂肪酸合成、胞内pH缓冲系统等更多机制的基因，同时结合定向进化技术改造关键耐酸基因，进一步提升模块的耐酸能力；三是将该模块化策略拓展应用于谷氨酸棒杆菌、酵母菌等其他工业微生物，以及高温、高盐、有机溶剂等其他工业胁迫条件的耐受性改造；四是结合代谢工程技术，优化工程菌株的碳代谢流和能量代谢，减少耐酸过程中的能量消耗，进一步提高低pH下的产物得率和生产强度；五是开展50 L及以上规模的中试发酵验证，评估该技术在工业化生产中的稳定性、经济性和环境效益，推动其产业化应用；六是结合多组学技术（转录组、蛋白质组、代谢组），系统解析RE-6和RE-38模块的全局调控网络，深入揭示低pH下大肠杆菌的胁迫响应和适应机制。
7.测量的数据及研究意义
测定了四种酸响应Pasr启动子的pH响应比数据，数据来自图1b。意义：明确了不同强度启动子的酸诱导特性，其pH响应比从1.8到3.6不等，为精确调控触发RNA的表达水平提供了定量依据，实现了耐酸基因表达的梯度调控。
测定了九对脚尖开关的荧光诱导倍数和基础表达水平数据，数据来自图S1a、b。意义：筛选出4对性能最优的触发-开关对（tr2N1+sw2N1、tr1N1+sw1N1等），其诱导倍数达4.0-10.0且基础表达低，为构建高效的酸响应调控模块奠定了基础。
测定了触发块文库和开关块文库的组装效率和覆盖度数据，数据来自图S2、S3。意义：验证了Golden Gate组装的高效性，触发块文库组装效率达91%、覆盖度达98%，确保了文库的多样性，为后续筛选提供了充足的候选模块。
测定了第一轮1140株菌株的最终OD₆₀₀比和最大生长速率比数据，数据来自图3b。意义：完成了大规模初筛，筛选出49株生长性能优于野生型115%以上的菌株，大幅缩小了候选范围，提高了筛选效率。
测定了第二轮49株菌株的生长性能数据，数据来自图3c。意义：进一步筛选出26株生长性能超过野生型120%的优良菌株，为后续验证提供了核心候选。
测定了26株重新转化菌株的生长性能数据，数据来自图3d。意义：排除了基因组自发突变的干扰，确认了耐酸表型完全由合成模块引起，最终得到9株稳定的耐酸工程菌株。
测定了工业菌株补料分批发酵的赖氨酸滴度、赖氨酸得率和最终OD₅₆₂数据，数据来自图4a、b、c。意义：验证了最优模块的工业应用价值，证明SC/RE-6和SC/RE-38在pH 5.5下的生产性能显著优于亲本菌株在pH 5.5下的水平，甚至超过亲本在pH 6.8下的水平。
测定了最优菌株中7个关键耐酸基因在指数期和稳定期的转录水平数据，数据来自图S5。意义：阐明了耐酸增强的分子机制，发现RE-6中sodA在指数期上调7倍以上，RE-38中sthA上调5.8倍，明确了ROS清除和氧化还原稳态在耐酸中的核心作用。
8.结论
本研究成功开发了一种基于脚尖开关的合成耐酸模块构建与筛选策略，通过将模块拆分为独立的触发块和开关块，实现了耐酸基因表达的精细调控和大规模文库的高效筛选。获得的两个最优合成模块RE-6和RE-38，能够使工业赖氨酸生产大肠杆菌在pH 5.5的低pH条件下，保持甚至超过亲本菌株在常规pH 6.8下的赖氨酸生产性能，显著提升了工业发酵的稳健性。转录分析表明，蛋白质质量控制（degP）、活性氧清除（sodA、katE）和氧化还原稳态（sthA）相关基因的协同上调，是工程菌株耐酸性增强的关键机制。该研究为工业微生物的胁迫耐受性改造提供了一种高效、模块化的新方法，不仅可应用于赖氨酸生产，还可拓展到其他有机酸、氨基酸和生物基化学品的发酵生产，具有重要的理论意义和工业应用价值。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪，在100孔无菌Honeycomb微板中进行大肠杆菌MG1655的耐酸生长测定，培养条件为37℃、连续振荡，每30分钟自动测定一次600 nm处的光密度值，连续监测24小时。这些生长曲线数据的研究意义主要体现在以下几个方面：
实现大规模耐酸菌株的高通量初筛：Bioscreen的100孔通量设计，使得本研究能够在单次实验中同时测定数百株菌株在pH 5.5下的生长性能。在10轮压力筛选后，仅用两轮实验就完成了1140株候选菌株的生长评估，相比传统摇瓶培养，筛选效率提升了数十倍。仪器的全自动化操作消除了人工取样带来的误差，保证了所有菌株在完全一致的温度、振荡和通气条件下培养，确保了不同菌株之间生长数据的可比性，为从海量候选模块中快速锁定优良菌株提供了标准化的技术平台。
精确量化菌株的耐酸生长动力学：每30分钟一次的高密度OD测定，能够完整记录大肠杆菌从延迟期、对数期到稳定期的整个生长动态，从而精确计算出最大生长速率（μmax）和最终OD₆₀₀两个核心生长参数。本研究创新性地采用这两个参数的相对比值（相对于野生型）作为筛选标准，比传统的单点OD测定更能全面反映菌株的耐酸能力。例如，部分菌株虽然最终生物量与野生型相当，但对数期生长速率显著提高，同样被选为候选菌株，避免了遗漏潜在的优良耐酸基因型。
验证合成模块的耐酸表型真实性：在重新转化验证实验中，Bioscreen的生长曲线数据发挥了关键作用。通过将从26株优良菌株中提取的质粒重新转化到野生型MG1655中，再次测定其在pH 5.5下的生长性能，成功排除了长期传代过程中基因组自发突变对耐酸表型的干扰。图3d的数据明确显示，9株重新转化的菌株仍保持了显著的耐酸优势，证明耐酸表型完全由合成模块介导，为后续模块的机制解析和工业应用提供了可靠的实验依据。
建立实验室生长与工业发酵的相关性：Bioscreen测定的实验室菌株生长性能与后续工业菌株的发酵性能表现出高度的一致性。在Bioscreen中生长表现最好的RE-6和RE-38模块，在BioLector微流控生物反应器的补料分批发酵中也展现出最优的赖氨酸生产性能。这种相关性表明，基于Bioscreen的生长筛选可以有效预测工业菌株的发酵潜力，大幅降低了后续大规模发酵验证的成本和风险，缩短了从实验室研究到工业应用的转化周期。
为耐酸机制解析提供动力学线索：生长曲线的不同变化模式能够为耐酸机制研究提供重要线索。例如，部分工程菌株的延迟期显著缩短，表明其能够更快地感知并适应酸性环境；而另一些菌株的对数期斜率更大，说明其在酸性条件下的代谢活性和增殖能力更强。这些生长动力学特征与后续RT-qPCR的转录分析结果相结合，能够更深入地理解合成模块如何通过调控不同的细胞过程来增强耐酸性。
支撑逐步筛选策略的高效实施：本研究采用的“压力富集-初筛-复筛-验证”四步逐步筛选策略，高度依赖Bioscreen的高通量和高精度特性。如果没有Bioscreen的支持，从理论上7.68×10⁴个候选模块中筛选出最优模块将是一项极其耗时费力的工作。Bioscreen的应用使得这种大规模、多轮次的筛选成为可能，为合成生物学中复杂多基因模块的高效筛选提供了一种通用的技术范式。