¹H-NMR Guided Isolation of Bioactive Compounds from Species of the Genus Piper
从派珀属物种中进行¹H-NMR引导生物活性化合物的分离
来源：Molecules 2025, 30, 2020.
1.摘要
生物活性天然产物的发现常受复杂混合物中活性化合物分离与表征难度的制约。此前本团队开发了基于¹H NMR的加权基因共表达网络分析（WGCNA）方法，用于识别与派珀属叶片提取物对植物、真菌和细菌模型生物生长抑制活性相关的光谱特征，实现了生物活性相关候选化合物的优先排序。本研究通过分离与抗真菌活性相关共振峰对应的化合物并验证其功效，验证了WGCNA方法的预测能力。采用生长抑制实验证实，分离得到的化合物（包括三种新型抗真菌剂）均表现出显著生物活性，其中一种化合物含有罕见的咪唑鎓杂环基序，代表了派珀属中的一个新结构类别。研究结果证实，基于¹H NMR的WGCNA是识别与生物活性相关结构类型的可靠工具，可简化复杂提取物中生物活性天然产物的发现流程。
2.关键词（中文）
基于¹H核磁共振的代谢组学、抗菌化合物、生物活性天然产物分离、加权基因共表达网络分析
3.研究目的
一是通过实验验证基于¹H NMR的WGCNA方法在复杂天然产物提取物中靶向识别和分离生物活性化合物的可靠性与预测能力；二是分离并系统表征与抗真菌活性光谱特征对应的化合物，明确派珀属植物中抗真菌活性成分的化学结构；三是发现派珀属中具有新颖骨架的抗真菌化合物，拓展该属植物的化学多样性认知；四是阐明活性化合物的构效关系，为后续天然产物药物发现提供高效的方法学支撑和先导化合物。
4.研究思路
研究分为五个递进阶段：第一阶段，基于前期对30种派珀属植物甲醇提取物的¹H NMR光谱和WGCNA分析结果，筛选出与酿酒酵母抑制活性显著相关的浅绿色模块（对应P. pseudobumbratum和P. peracuminatum）和深红色模块（对应P. holdridgeanum），确定目标特征共振峰；第二阶段，以目标NMR共振峰为导向，对三种目标植物的粗提物进行C18反相色谱预分离，通过¹H NMR跟踪各馏分中的目标峰，富集活性组分；第三阶段，利用制备型反相色谱对富集馏分进行进一步纯化，获得纯化合物，通过一维和二维NMR（COSY、HSQC、HMBC、NOESY）及高分辨质谱（HRMS）进行结构解析，对新颖化合物进行全合成验证；第四阶段，采用Bioscreen高通量生长分析平台，测定各纯化合物对酿酒酵母的生长抑制活性，计算IC₅₀值，评估其抗真菌效力和选择性；第五阶段，综合结构解析和活性数据，验证WGCNA方法的准确性，分析活性化合物的构效关系。
5.研究亮点
一是首次通过靶向分离实验系统验证了基于¹H NMR的WGCNA方法的有效性，建立了“光谱特征-生物活性-化合物结构”的直接关联，为天然产物发现提供了一种高效的靶向策略，避免了传统生物活性导向分离的盲目性和重复性；二是从派珀属中发现了两种新型抗真菌化合物，其中piperholdripine（4）含有罕见的C6,C8-双辛基取代2,3-二氢-1H-吲哚嗪鎓骨架，是派珀属中首次报道的该类生物碱，显著拓展了该属植物的化学结构多样性；三是实现了对低丰度活性成分的高效分离，P. holdridgeanum中的活性成分含量极低且无强紫外吸收，传统分离方法难以检测，通过靶向NMR特征峰（δH 8.61）成功实现了分离和表征；四是明确了派珀属化合物抗真菌活性的关键结构特征，证实异戊烯基取代和二氢查尔酮基序是决定其抗真菌活性的重要结构基序，为后续结构优化和药物开发提供了明确方向。
6.可延伸方向
一是将基于¹H NMR的WGCNA方法扩展到抗菌、抗病毒、抗肿瘤等更多生物活性筛选体系，以及其他植物类群和微生物来源的天然产物，建立通用的靶向发现平台；二是结合酵母全基因组缺失突变体库和转录组学技术，深入研究piperholdripine（4）和macatrichocarpin B（2）的抗真菌作用机制和细胞靶点；三是对活性化合物进行结构修饰，通过化学合成引入不同取代基，优化其抗真菌活性、选择性和成药性；四是评估这些化合物在农业真菌病害防治（如作物白粉病、灰霉病）和临床抗真菌药物开发中的应用潜力，开展体内活性和安全性评价；五是优化派珀属植物中活性成分的提取、分离和纯化工艺，建立规模化制备方法，为后续研究和应用提供充足的样品；六是结合代谢组学和基因组学技术，解析派珀属中这些活性化合物的生物合成途径，为通过合成生物学手段提高产量奠定基础。
7.测量的数据及研究意义
测定了三种派珀属植物粗提物的¹H NMR光谱及与WGCNA模块的关联数据，数据来自图1A、B。意义：明确了与抗真菌活性显著相关的特征化学位移区域，浅绿色模块对应δH 5.33、1.82、1.78、1.74的异戊烯基质子信号，深红色模块对应δH 8.53–8.62的芳香质子信号，为后续靶向分离提供了精准的导向。
测定了化合物(2’Z,6’E,10’E)-piperoic acid（1）的¹H、¹³C NMR及二维NMR（COSY、HSQC、HMBC、NOESY）数据，数据来自表1。意义：完成了该新异构体的完整结构解析，确定了其三个双键的立体构型，明确了其与已知piperoic acid的结构差异。
测定了化合物macatrichocarpin B（2）的¹H、¹³C NMR及二维NMR数据，数据来自表2。意义：确认了该化合物的结构，首次在派珀属中发现该类二氢查尔酮衍生物，拓展了派珀属的化学成分类型。
测定了化合物14-prenylmacatrichocarpin B（3）的¹H、¹³C NMR及二维NMR数据，数据来自表3。意义：解析了该新化合物的结构，为后续构效关系分析提供了对比样本。
测定了化合物piperholdripine（4）的¹H、¹³C NMR及二维NMR数据，数据来自表4和图3。意义：完成了该新型吲哚嗪鎓生物碱的结构解析，明确了其母核结构和取代基位置，是派珀属中该类结构的首次报道。
测定了piperholdripine（4）的全合成数据，数据来自方案1。意义：通过化学合成进一步确证了其结构的正确性，为后续大量制备和结构修饰提供了可行的合成路线。
测定了P. pseudobumbratum和P. peracuminatum来源化合物的抗真菌活性数据，包括代表性生长曲线、生长曲线下面积（AUC）和剂量-反应曲线，数据来自图4A、B、C。意义：定量评估了化合物1-3的抗真菌活性，确定macatrichocarpin B（2）的IC₅₀为10.5 µM，发现第二个异戊烯基的引入会显著降低活性，明确了构效关系。
测定了P. holdridgeanum来源化合物的抗真菌活性数据，包括代表性生长曲线、AUC值和剂量-反应曲线，数据来自图5A、B、C。意义：证实piperholdripine（4）具有强效抗真菌活性，IC₅₀为4.9 µM，且对大肠杆菌无抑制作用，具有良好的真菌选择性。
测定了三种植物粗提物和所有分离化合物的抗真菌活性汇总数据，数据来自表5。意义：系统比较了粗提物和纯化合物的活性水平，验证了WGCNA预测的准确性，明确了各活性化合物在粗提物抗真菌功效中的贡献。
8.结论
本研究成功验证了基于¹H NMR的加权基因共表达网络分析（WGCNA）方法在复杂天然产物提取物中靶向识别和分离生物活性化合物的可靠性。通过该方法，从三种派珀属植物中分离得到了三种具有抗真菌活性的化合物，包括两种新化合物：(2’Z,6’E,10’E)-piperoic acid（1）和piperholdripine（4）。其中piperholdripine（4）含有罕见的吲哚嗪鎓杂环骨架，代表了派珀属中的一个全新结构类别，且表现出最强的抗真菌活性（IC₅₀=4.9 µM）和真菌选择性。研究还发现，异戊烯基取代是派珀属化合物抗真菌活性的关键结构特征，但双异戊烯基取代会导致活性下降。这些结果表明，基于¹H NMR的WGCNA方法能够显著提高天然产物发现的效率，尤其适用于低丰度、无紫外吸收活性成分的分离，为新型抗真菌先导化合物的发现提供了有力的工具和新的思路。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪，在100孔无菌蜂窝板中进行酿酒酵母BY4741的生长抑制实验，培养条件为30℃、连续振荡，每5分钟自动测定一次600 nm处的光密度值，连续监测18小时，每个样品设置3个生物学重复和9个技术重复。这些生长曲线数据的研究意义主要体现在以下几个方面：
实现高通量、标准化的抗真菌活性筛选：Bioscreen仪器的100孔通量设计，使得本研究能够同时测定粗提物、5种分离化合物及多个浓度梯度的抗真菌活性，大幅缩短了实验周期。与传统的试管培养和人工定时取样相比，仪器的自动化操作消除了人为误差，保证了所有样品在完全一致的温度、振荡和光照条件下培养，确保了不同化合物、不同浓度之间活性数据的可比性，为准确评估各化合物的抗真菌效力提供了标准化的实验平台。
动态捕捉微生物生长的全过程变化：每5分钟一次的高密度OD测定，能够完整记录酿酒酵母从延迟期、对数期到稳定期的整个生长动态。例如，图4A清晰显示，经macatrichocarpin B（2）处理的酵母细胞延迟期显著延长，而对数期生长速率与对照组无明显差异，这种精细的生长模式变化是单点OD测定无法捕捉到的。这些动态数据不仅能更全面地反映化合物对微生物生长的影响，还能为推测其作用机制提供重要线索，如延迟期延长通常提示化合物作用于细胞壁合成或细胞分裂过程。
精确量化生长抑制活性并计算IC₅₀值：基于连续的生长曲线数据，可以计算生长曲线下面积（AUC），通过AUC值定量评估化合物对微生物生长的抑制程度。本研究中，图4C和图5C的剂量-反应曲线就是基于不同浓度化合物处理后的AUC值绘制的，通过非线性拟合能够精确计算出各化合物的半最大抑制浓度（IC₅₀）。这种基于AUC的定量方法比传统的终点OD法更准确、更灵敏，能够区分不同化合物之间细微的活性差异，为构效关系分析提供了可靠的量化指标。
验证化合物的生物活性选择性：本研究利用Bioscreen仪器同时测定了piperholdripine（4）对酿酒酵母和大肠杆菌的生长抑制作用。结果显示，该化合物在100 µM浓度下对酿酒酵母的生长抑制率超过80%，但对大肠杆菌无明显影响。标准化的实验条件保证了两种微生物实验结果的可比性，明确了piperholdripine（4）具有真菌选择性，为其后续开发为特异性抗真菌药物提供了重要依据。
验证WGCNA方法的预测准确性：通过Bioscreen测定的纯化合物活性数据，与前期WGCNA分析预测的光谱特征-活性关联高度一致。例如，深红色模块对应的piperholdripine（4）表现出最强的抗真菌活性，浅绿色模块对应的化合物1和2也具有显著活性，而与非活性模块对应的化合物3和5则无明显抗真菌作用。这些实验结果直接验证了WGCNA方法能够准确识别与生物活性相关的光谱特征，为该方法的推广应用提供了坚实的实验支撑。
为后续作用机制研究提供基础数据：生长曲线的不同变化模式可以提示化合物的潜在作用靶点。例如，piperholdripine（4）处理后酵母细胞的生长曲线呈现出浓度依赖性的生长抑制，且无明显的延迟期延长，提示其可能作用于细胞代谢或能量产生过程。这些基于Bioscreen的生长动力学数据，为后续结合转录组学、蛋白质组学等技术深入研究化合物的作用机制奠定了基础。