Growth and Rhamnolipid Production Performance of Pseudomonas aeruginosa on Crude Biomass Carbohydrates and Bioenhancer-Based Growth Media
铜绿假单胞菌在粗生物质碳水化合物和基于生物增强剂的生长培养基上的生长与鼠李糖脂生成表现
来源：Appl. Sci. 2025, 15, 2531
1.摘要
本研究评估了四种碳水化合物源（葡萄糖、甘油、大豆皮水解物SHH、模拟大豆皮水解物MSH）结合生物增强剂及其他培养基组分对铜绿假单胞菌PAO1鼠李糖脂生产的优化效果。旨在探究人类神经内分泌生物增强剂（去甲肾上腺素NE、多巴胺DP）在含可持续粗生物质碳水化合物的培养基中对细菌生长性能和鼠李糖脂滴度的影响。通过高通量响应面研究优化了碳水化合物浓度、生物增强剂浓度和铁浓度，以获得最佳生长速率。高通量实验中，所有糖源的微生物生长速率在0.2-0.5 log OD h⁻¹（600nm）之间，其中葡萄糖在2.5%浓度、160μM去甲肾上腺素、66μM多巴胺、0.03%铁的最优组合下获得最高生长速率。进一步在100mL摇瓶中验证了该培养基的生长和鼠李糖脂生产性能，结果显示葡萄糖和甘油基培养基的最高OD和鼠李糖脂滴度分别达到2.78g/L和2.72g/L，而SHH和MSH基培养基的滴度显著较低，分别为1.98g/L和1.72g/L。在实验评估的浓度范围内，未观察到去甲肾上腺素和多巴胺的显著生长增强效应。
2.关键词（中文）
铜绿假单胞菌PAO1、粗生物质水解物、鼠李糖脂、生物增强剂、生长培养基
3.研究目的
一是评估不同类型碳源（纯糖葡萄糖、甘油与粗生物质来源的大豆皮水解物及其模拟混合物）作为铜绿假单胞菌生长和鼠李糖脂生产底物的可行性与效率；二是探究人类神经内分泌生物增强剂（去甲肾上腺素、多巴胺）和铁浓度在含粗生物质碳水化合物的培养基中对细菌生长速率和鼠李糖脂合成的调控作用；三是通过高通量响应面方法系统优化培养基关键组分，建立生长速率预测模型，获得最优培养基配方；四是在摇瓶规模验证优化后培养基的性能，并评估酵母提取物替代人转铁蛋白增强生物增强剂效果的可能性，为低成本、可持续的鼠李糖脂工业化生产提供理论依据和技术支撑。
4.研究思路
研究分为四个递进阶段：第一阶段，采用复合酶解法制备大豆皮水解物（SHH），并根据其糖组成配制模拟大豆皮水解物（MSH）作为对照，测定碳水化合物转化率；第二阶段，采用中心复合设计（CCD）的响应面方法，以对数期生长速率为响应值，在Bioscreen高通量平台上优化四种碳源的浓度、去甲肾上腺素浓度、多巴胺浓度和铁浓度四个关键因素；第三阶段，根据响应面模型预测结果确定最优培养基配方，在100mL摇瓶中进行验证实验，设置添加和不添加1.5g/L酵母提取物的两组平行实验，在0、3、6、24、48小时取样测定OD600和鼠李糖脂浓度；第四阶段，统计分析各因素对生长速率和鼠李糖脂产量的影响，探讨生物增强剂未发挥预期效果的机制，综合评估粗生物质底物在鼠李糖脂生产中的应用潜力。
5.研究亮点
一是首次系统评估了大豆皮水解物作为铜绿假单胞菌生产鼠李糖脂的可再生底物，同时设置纯糖模拟混合物作为对照，明确了粗生物质复杂组分对细菌生长和产物合成的影响；二是创新性地将人类神经内分泌生物增强剂与粗生物质培养基结合，探索了通过外源信号分子低成本提升鼠李糖脂产量的新途径；三是采用Bioscreen高通量生长分析平台结合响应面法，高效完成了4因素5水平的培养基优化，大幅提高了实验效率和数据可靠性；四是明确了生物增强剂作用的关键限制因素，证明酵母提取物无法替代人转铁蛋白介导去甲肾上腺素和多巴胺的生长增强效应，为后续该体系的工业化应用指明了突破方向。
6.可延伸方向
一是筛选低成本的人转铁蛋白替代物（如乳清蛋白、大豆分离蛋白、牛血清白蛋白），验证其能否与生物增强剂协同促进铜绿假单胞菌生长和鼠李糖脂合成；二是优化大豆皮的预处理和酶解工艺，提高可发酵糖转化率，同时去除水解物中可能存在的酚类、呋喃类等抑制性物质；三是采用分批补料发酵、连续发酵或固定化细胞发酵等工艺，进一步提高粗生物质培养基上的鼠李糖脂产量和生产强度；四是通过代谢工程改造铜绿假单胞菌，增强其对木糖、阿拉伯糖、半乳糖等五碳糖和混合糖的利用能力，提高粗生物质底物的碳转化率；五是评估玉米秸秆、麦麸、甘蔗渣、酒糟等其他农业废弃物作为鼠李糖脂生产底物的可行性，拓展可再生原料的选择范围；六是研究生物增强剂与其他发酵调控策略（如pH调控、溶氧调控）的协同效应，进一步提升鼠李糖脂的生产效率。
7.测量的数据及研究意义
测定了四种碳水化合物培养基中实际与预测生长速率的散点分布，数据来自图2(a-d)。意义：验证了响应面模型的拟合效果，葡萄糖、甘油、SHH、MSH的R²值分别为0.83、0.96、0.93和0.70，证明模型能较好预测不同碳源下的生长速率，同时明确了葡萄糖是最适合铜绿假单胞菌生长的碳源，最高生长速率达0.5 log OD h⁻¹。
测定了葡萄糖基培养基中各因素交互作用的响应面图，数据来自图3。意义：揭示了碳水化合物浓度是影响生长速率的最显著因素，且仅在葡萄糖基培养基中观察到去甲肾上腺素浓度及其与碳水化合物浓度的交互作用对生长速率有显著影响，为葡萄糖基培养基的进一步优化提供了依据。
测定了甘油基培养基中各因素交互作用的响应面图，数据来自图4。意义：显示碳水化合物浓度是唯一显著影响甘油基培养基中生长速率的因素，生物增强剂和铁浓度无显著作用，说明甘油代谢途径中不存在生物增强剂的作用靶点。
测定了SHH基培养基中各因素交互作用的响应面图，数据来自图5。意义：表明粗生物质水解物培养基中，碳水化合物浓度仍是主要影响因素，生物增强剂和铁的作用不显著，可能与水解物中复杂组分对信号通路的干扰有关。
测定了MSH基培养基中各因素交互作用的响应面图，数据来自图6。意义：与SHH结果高度一致，排除了水解物中杂质的影响，证明混合糖代谢本身限制了生物增强剂的作用效果。
测定了100mL摇瓶中不同培养基的生长曲线（OD600随时间变化），数据来自图7。意义：验证了Bioscreen高通量优化结果，葡萄糖和甘油基培养基的生物量显著高于SHH和MSH，添加酵母提取物能小幅提高生物量，但未改变不同碳源间的差异，且未观察到文献报道的生物增强剂导致的对数期斜率突变。
测定了100mL摇瓶中48小时的鼠李糖脂浓度，数据来自图8。意义：明确了不同碳源的鼠李糖脂生产能力，葡萄糖+酵母提取物（2.78g/L）、甘油（2.72g/L）、甘油+酵母提取物（2.65g/L）产量最高且无显著差异，SHH和MSH产量较低（1.72-1.98g/L），为工业生产中碳源的选择提供了直接数据支撑。
8.结论
本研究成功证明了粗生物质碳水化合物（大豆皮水解物）可作为铜绿假单胞菌生产鼠李糖脂的可再生底物，为降低生物表面活性剂的生产成本、提高农业废弃物的附加值提供了可行途径。通过高通量响应面法优化了培养基组分，确定了2.5%为最优碳水化合物浓度，但在实验浓度范围内，去甲肾上腺素和多巴胺未表现出显著的生长和鼠李糖脂增强效果，其核心原因是培养基中缺乏人转铁蛋白，而酵母提取物无法替代其介导铁转运和生长信号传导的功能。葡萄糖和甘油仍是铜绿假单胞菌生产鼠李糖脂的最优碳源，摇瓶中最高产量达2.78g/L，与文献报道的纯糖培养基水平相当。大豆皮水解物的鼠李糖脂产量虽低于纯碳源，但通过预处理工艺优化、菌株代谢改造和发酵过程调控仍有较大提升空间，具有良好的工业应用潜力。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪，在108孔无菌蜂窝板中进行高通量响应面优化实验，每孔培养体积500μL，培养条件为37℃、pH7.0、连续振荡，每15分钟自动测定一次600nm处的光密度值，连续监测48小时，共完成27种实验条件×4种碳源的生长曲线测定。这些生长曲线数据的研究意义主要体现在以下几个方面：
实现多因素多水平的高效培养基优化：传统摇瓶培养受限于通量，无法同时处理大量实验条件，而Bioscreen的高通量特性使得本研究能够在单次实验中完成4因素（碳水化合物浓度、铁浓度、去甲肾上腺素浓度、多巴胺浓度）×5水平的中心复合设计，共获得108组独立的生长动力学数据。这大幅缩短了培养基优化周期，避免了传统分批实验中环境波动带来的系统误差，保证了不同条件下数据的可比性和可靠性，为响应面模型的建立提供了高质量的基础数据。
精准获取对数期生长速率作为响应值：由于Bioscreen仪器无法自动稀释样品，当OD值超过1.0后会出现线性偏差，因此本研究创新性地选择0-10小时对数期的生长速率（log OD h⁻¹）作为响应值，而非最终OD值。通过每15分钟一次的高密度OD测定，能够精确拟合对数期的生长曲线，计算出准确的比生长速率，真实反映不同培养基条件下细菌的生长活力，避免了单点OD测定带来的偶然性误差，显著提高了响应面模型的预测准确性。
系统揭示不同碳源的生长动力学差异：通过同步测定四种碳源的生长曲线，明确了铜绿假单胞菌对不同碳源的代谢偏好性。数据显示葡萄糖的最高生长速率达0.5 log OD h⁻¹，显著高于甘油（0.35 log OD h⁻¹）和粗生物质来源的SHH、MSH（0.25-0.3 log OD h⁻¹）。这一差异直接反映了细菌对六碳单糖的优先利用特性，为后续摇瓶实验中鼠李糖脂产量的差异提供了生理学解释，也为碳源的选择和优化提供了依据。
快速筛选生物增强剂的作用效果：Bioscreen的实时连续监测能力能够清晰展示不同浓度去甲肾上腺素和多巴胺对细菌生长动态的影响。实验结果显示，除葡萄糖基培养基中去甲肾上腺素表现出微弱的促进作用外，其他条件下生物增强剂均未显著提高生长速率。这一结论是基于数百个生长曲线数据点的统计分析得出的，具有较高的可信度，避免了传统方法中因取样频率低而遗漏生长动态变化的问题，快速排除了无效的实验条件。
为摇瓶验证实验提供可靠的优化方向：基于Bioscreen生长数据建立的二次多项式响应面模型，预测出最优培养基配方为2.5%碳水化合物、160μM去甲肾上腺素、66μM多巴胺、0.03%铁。后续100mL摇瓶实验验证了该配方的有效性，证明Bioscreen高通量筛选结果能够准确指导更大规模的发酵实验，大幅降低了优化过程的试错成本和时间成本。
明确生物增强剂作用的关键限制因素：通过对比本研究的Bioscreen生长数据与文献报道，发现生物增强剂未发挥预期效果的核心原因是培养基中缺乏人转铁蛋白。Bioscreen的数据清晰显示，即使在最高浓度的去甲肾上腺素和多巴胺条件下，生长速率也未出现文献报道的数倍提升，这直接证明了转铁蛋白是去甲肾上腺素/多巴胺介导生长增强的必需因子，为后续该体系的工业化应用明确了关键突破口。