Characterization of a heme-degrading enzyme that mediates fitness and pathogenicity in Enterococcus faecalis
一种介导粪肠球菌适应性和致病性的血红素降解酶的特性
来源：May 2025 Volume 16 Issue 5 10.1128/mbio.00146-25
1.摘要
粪肠球菌是人体肠道共生菌，也是导致医院获得性感染的主要机会致病菌之一，其毒力与克服宿主营养免疫、在恶劣环境中生存的能力密切相关。本研究针对粪肠球菌能利用血红素作为铁源但缺乏经典血红素氧合酶的矛盾现象，通过生物信息学分析鉴定出一个大肠杆菌厌氧胆素合酶ChuW的同源基因OG1RF_RS05575。研究发现，敲除该基因会导致粪肠球菌在厌氧条件下细胞内血红素大量积累并产生生长缺陷，而在有氧条件下无明显表型。动物实验表明，RS05575单敲除菌株在小鼠肠道定植、小鼠腹膜炎和兔感染性心内膜炎模型中的毒力均显著下降，同时敲除所有5个铁转运体和RS05575的六重突变体毒力衰减最为严重。本研究首次在革兰氏阳性菌中鉴定并表征了厌氧血红素降解酶，且首次将这类酶的活性与细菌的宿主定植和致病性直接关联，为开发新型抗菌药物提供了潜在靶点。
2.关键词（中文）
血红素降解、肠球菌、兼性厌氧菌、粪肠球菌、金属稳态、毒力因子
3.研究目的
一是阐明粪肠球菌利用宿主血红素作为铁源的分子机制，特别是厌氧条件下的血红素降解途径；二是鉴定并功能表征粪肠球菌中的厌氧血红素降解酶，明确其在血红素稳态中的作用；三是探究该酶在粪肠球菌的宿主适应性（肠道定植）和致病性（腹膜炎、感染性心内膜炎）中的关键作用；四是分析该酶在革兰氏阳性菌中的分布特征，评估其作为广谱毒力因子的可能性。
4.研究思路
研究分为四个连续阶段：第一阶段，通过55Fe同位素示踪实验和RT-qPCR分析，验证粪肠球菌能优先利用血红素作为铁源，并调控相关金属转运基因的表达；第二阶段，通过生物信息学筛选候选基因RS05575，构建单敲除、回补以及与Δ5Fe菌株的双敲除突变体；第三阶段，在不同氧浓度（有氧、微氧、严格厌氧）和不同铁源（无铁、FeSO4、血红素）条件下，测定各菌株的生长曲线、细胞内血红素含量以及血红素吸收和降解动力学，验证RS05575的酶功能；第四阶段，利用小鼠肠道定植模型、小鼠系统性腹膜炎模型和兔感染性心内膜炎模型，系统评估RS05575对粪肠球菌毒力和宿主适应性的影响。
5.研究亮点
一是首次在革兰氏阳性菌中发现并表征厌氧血红素降解酶，填补了该领域的空白，拓展了对细菌血红素代谢途径的认知；二是首次建立厌氧血红素降解与细菌致病性的直接联系，揭示了粪肠球菌在宿主低氧环境中生存和致病的新机制；三是系统阐明了粪肠球菌的血红素稳态调控网络，发现其在有氧和厌氧条件下采用不同的血红素降解策略；四是发现该酶广泛存在于链球菌、葡萄球菌等重要致病菌中，提示其可能是一类普遍存在的毒力因子，具有重要的临床意义。
6.可延伸方向
一是深入研究RS05575的酶学性质，包括底物特异性、催化机制、动力学参数以及rSAM辅因子的作用；二是探究粪肠球菌在有氧条件下的血红素降解机制，明确其与厌氧途径的协同作用；三是研究RS05575在多微生物感染中的功能，特别是粪肠球菌与金黄色葡萄球菌等致病菌的互作；四是开发以RS05575为靶点的新型抗菌药物，用于治疗多重耐药粪肠球菌引起的感染；五是验证该酶在其他革兰氏阳性致病菌（如化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌）中的功能，评估其作为广谱抗菌靶点的潜力。
7.测量的数据及研究意义
测定了55Fe在有无血红素和FeSO4竞争条件下的吸收速率，数据来自图1A。意义：直接证明血红素能更有效地抑制游离铁的吸收，说明血红素是粪肠球菌的优先铁源。
测定了血红素处理前后铁、锰转运基因和血红素外排基因的转录水平，数据来自图1B。意义：揭示了血红素对粪肠球菌金属稳态的调控机制，即抑制铁吸收、增强锰吸收和血红素外排以维持平衡。
测定了有无过量铁条件下的细胞内血红素含量，数据来自图1C。意义：发现过量铁会导致细胞内血红素积累，提示铁充足时粪肠球菌会减缓血红素降解以避免铁中毒。
进行了RS05575与大肠杆菌ChuW的氨基酸序列比对，数据来自图2A。意义：鉴定出保守的rSAM CXXXCXXC基序和关键活性天冬氨酸残基，支持RS05575为厌氧胆素合酶同源物。
叠加了RS05575与ChuW的AlphaFold2预测结构，数据来自图2B。意义：显示两者三维结构高度相似（RMSD=3.01，TM-score=0.78），进一步验证了其功能同源性。
展示了RS05575的基因结构，数据来自图2C。意义：明确其为单顺反子，侧翼为镁转运蛋白mgtA和应激调节因子hrcA，提示其可能与金属稳态和应激反应相关。
构建了RS05575同源物的系统发育树，数据来自图3。意义：显示该酶广泛存在于肠球菌科、链球菌和葡萄球菌等兼性厌氧革兰氏阳性菌中，具有重要的进化和普遍意义。
测定了各菌株在9种不同氧浓度和铁源组合条件下的生长曲线，数据来自图4A-I。意义：发现ΔRS05575仅在严格厌氧+血红素条件下完全不能生长，回补后恢复，直接证明该酶的功能是厌氧特异性的。
测定了不同氧浓度梯度下的细胞内血红素含量，数据来自图5B-C。意义：显示ΔRS05575在低氧和厌氧条件下细胞内血红素含量翻倍，直接证明其参与厌氧条件下的血红素降解。
测定了各菌株的血红素吸收动力学，数据来自图6A。意义：发现Δ5Fe菌株的血红素吸收速率显著高于野生型，而RS05575敲除不影响吸收，说明该酶作用于血红素吸收后的降解步骤。
测定了各菌株的血红素降解动力学，数据来自图6B。意义：显示野生型和Δ5Fe菌株的细胞内血红素在3小时内分别下降35%和65%，而敲除菌株保持稳定，提供了该酶催化血红素降解的直接证据。
测定了RS05575在不同条件下的转录水平，数据来自图7A-D。意义：证明其表达不受Fur、铁、血红素、氧浓度和生长阶段的影响，为组成型表达，提示其在基础代谢中的重要性。
测定了小鼠腹膜炎模型中各组织的细菌载量，数据来自图8A-E。意义：显示ΔRS05575在腹腔、肝脏、肾脏的载菌量显著降低，Δ5FeΔRS05575在所有组织中载菌量最低，证明该酶对系统性感染的重要性。
测定了兔感染性心内膜炎模型中各菌株的竞争恢复率，数据来自图9B。意义：显示Δ5Fe和Δ5FeΔRS05575的恢复率分别仅为12%和<5%，证明该酶在感染性心内膜炎这种高血红素环境中的关键作用。
测定了小鼠肠道定植模型中粪便的细菌载量，数据来自图10B。意义：显示所有突变体的定植能力均显著下降，Δ5FeΔRS05575最差，证明该酶对粪肠球菌在肠道厌氧环境中的生存至关重要。
列出了本研究使用的所有细菌菌株及其基因型，数据来自表1。意义：提供了实验材料的标准化信息，保证了实验的可重复性。
8.结论
本研究首次在革兰氏阳性菌中鉴定并功能表征了厌氧血红素降解酶RS05575，系统阐明了其在粪肠球菌血红素稳态和致病性中的关键作用。研究表明，粪肠球菌能优先利用宿主血红素作为铁源，RS05575在低氧和厌氧条件下负责降解血红素释放铁，同时避免细胞内血红素积累导致的毒性。该酶为组成型表达，不受传统铁调节因子Fur的调控。动物实验证实，RS05575是粪肠球菌的重要毒力因子，在肠道定植、系统性腹膜炎和感染性心内膜炎中均发挥不可或缺的作用。鉴于该酶广泛存在于多种重要的革兰氏阳性致病菌中，本研究不仅揭示了细菌厌氧血红素代谢的新机制，也为开发新型广谱抗菌药物提供了极具潜力的靶点。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪，在96孔板中高通量测定了野生型OG1RF、ΔRS05575、ΔRS05575c、Δ5Fe、Δ5FeΔRS05575等菌株在9种不同氧浓度和铁源组合条件下的生长曲线，每30分钟自动测定一次600 nm处的光密度值，连续监测18小时。这些数据的研究意义主要体现在以下几个方面：
高通量快速筛选生长表型：Bioscreen可同时处理96个样品，本研究中对5个菌株、9种条件及3个生物学重复进行了同步测试，在18小时内完成了所有生长实验，极大提高了实验效率。与传统摇瓶培养相比，避免了人工操作带来的误差，保证了数据的准确性和重复性，加速了基因功能的验证进程。
精准定量生长动力学参数：通过连续监测OD600的动态变化，可精确计算各菌株的延迟期、比生长速率、最大生物量等关键动力学参数。数据清晰显示，ΔRS05575在严格厌氧+血红素条件下的延迟期无限延长，完全不能生长，而在有氧和微氧条件下生长正常。这一特异性表型直接证明了RS05575的功能是严格厌氧依赖的，为后续的机制研究指明了方向。
标准化生长表型比较：Bioscreen的标准化培养条件（37℃恒温、最大振幅连续振荡、均一的200 μL培养体系）消除了环境因素的干扰，保证了不同菌株、不同条件之间生长数据的可比性。通过对比不同铁源条件下的生长曲线，明确了RS05575的生长缺陷仅在血红素作为唯一铁源时出现，排除了铁缺乏本身的影响，进一步验证了其在血红素代谢中的功能。
验证基因功能的核心证据：生长曲线数据与后续的细胞内血红素含量、血红素降解动力学数据形成了完整的证据链。敲除菌株在厌氧+血红素条件下的生长缺陷，是由于细胞内血红素大量积累导致的毒性，而回补菌株完全恢复生长则从遗传学上验证了RS05575的功能。这是证明一个基因参与特定代谢途径的最直接、最有力的证据之一。
建立体外表型与体内致病性的联系：生长曲线数据显示，ΔRS05575仅在厌氧条件下存在生长缺陷，而宿主的肠道、腹腔、心脏瓣膜等感染部位都是典型的低氧或厌氧环境，且富含血红素。这为后续动物实验中观察到的毒力下降提供了合理的解释，建立了体外生长表型与体内致病性之间的因果关系，深化了对粪肠球菌致病机制的理解。
为抗菌药物筛选提供平台：基于Bioscreen的高通量生长测定方法，可快速筛选针对RS05575的小分子抑制剂。通过测定化合物处理后ΔRS05575和野生型菌株的生长差异，可特异性地识别抑制该酶活性的化合物，为开发新型抗菌药物提供了高效的筛选平台。