Mechanism of Lysobacter enzymogenes resistance toward fungi induced by fungal-derived signal α-terpinene
真菌衍生信号α-萜品烯诱导的产酶溶杆菌抗真菌机制
来源：Applied and Environmental Microbiology October 2025 Volume 91 Issue 10 10.1128/aem.01471-25
1.摘要
细菌-真菌互作是生态系统功能的关键驱动力，其分子机制尚未完全阐明。化学信号是微生物交流的重要介质，但真菌分泌的萜类化合物的信号传导机制仍不明确。本研究以环境细菌产酶溶杆菌YC36（LeYC36）为对象，系统探究了真菌衍生萜类α-萜品烯对其生物膜形成和抗真菌活性的调控机制。结果表明，α-萜品烯通过促进抗真菌效应物热稳定抗真菌因子（HSAF）和真菌细胞壁水解酶GluB的生物合成，以及生物膜形成，增强了LeYC36在细菌-真菌互作中的竞争力。进一步揭示了α-萜品烯介导的信号通路：LeYC36通过双组分系统的传感器组氨酸激酶LeCzcS检测真菌信号α-萜品烯，将信息传递给调节因子LeCzcR；磷酸化的LeCzcR直接刺激下游功能基因Lehsaf、LegluB和Lepsl的表达，最终提升LeYC36对抗真菌的能力。本研究阐明了α-萜品烯在细菌-真菌互作中的作用及其调控机制，为微生物间的交流和协同适应提供了新视角。
2.关键词（中文）
产酶溶杆菌YC36、细菌-真菌互作、热稳定抗真菌因子、β-1,3-葡聚糖酶GluB、生物膜
3.研究目的
一是阐明真菌衍生信号分子α-萜品烯调控产酶溶杆菌抗真菌活性和生物膜形成的分子机制；二是鉴定LeYC36中感知α-萜品烯的受体蛋白及完整的信号传导通路；三是揭示该信号通路在天然细菌-真菌互作中的生态功能；四是为开发基于微生物信号分子的新型生物防治技术提供理论基础和作用靶点。
4.研究思路
研究分为五个递进阶段：第一阶段，通过共培养实验和单独培养实验，验证α-萜品烯对LeYC36抗真菌活性的影响，排除其直接作用于真菌或促进细菌生长的可能性；第二阶段，通过比较转录组分析筛选α-萜品烯诱导的差异表达基因，鉴定出关键的抗真菌效应物基因和生物膜合成基因，并通过基因敲除、回补和功能实验验证其作用；第三阶段，基于转录组结果筛选候选双组分系统，通过基因敲除和表型实验确定感知α-萜品烯的LeCzcS/LeCzcR系统；第四阶段，通过生物层干涉术（BLI）验证LeCzcS与α-萜品烯的直接结合，通过电泳迁移率变动分析（EMSA）验证磷酸化LeCzcR对下游基因启动子的直接调控，并确定关键磷酸化位点；第五阶段，通过与天然产α-萜品烯的真菌禾谷镰孢共培养，验证该信号通路在生理条件下的功能。
5.研究亮点
一是首次完整揭示了真菌萜类信号α-萜品烯调控细菌抗真菌活性和生物膜形成的分子通路，填补了真菌萜类信号跨界调控细菌生理功能的机制空白；二是发现双组分系统LeCzcS/LeCzcR进化出了感知萜类信号的新功能，不同于其在铜绿假单胞菌中调控锌稳态和抗生素抗性的传统功能，拓展了对双组分系统功能多样性的认知；三是阐明了LeYC36响应真菌信号的“进攻+防御”双重策略：通过上调HSAF和GluB增强抗真菌进攻能力，同时通过促进生物膜形成构建防御屏障，全面提升生态竞争力；四是验证了该信号通路在天然细菌-真菌互作中的生理作用，为利用微生物信号分子改良生防细菌、提高生物防治效果提供了新的思路和靶点。
6.可延伸方向
一是解析LeCzcS蛋白与α-萜品烯结合的晶体结构，明确其分子识别的关键氨基酸残基和结合模式；二是鉴定禾谷镰孢中α-萜品烯的生物合成途径，通过基因敲除构建α-萜品烯缺陷菌株，进一步验证其在细菌-真菌互作中的生理功能；三是探索LeCzcS/LeCzcR信号通路在其他溶杆菌属菌株及重要生防细菌中的保守性，评估其作为广谱生防调控靶点的潜力；四是开发基于α-萜品烯或LeCzcS/LeCzcR系统的生物防治剂，通过外源添加信号分子或工程化改造生防菌株，提高其田间抗真菌效果；五是研究该信号通路与其他细菌信号通路（如群体感应、c-di-GMP信号）的交叉对话，解析复杂微生物群落中的信号调控网络。
7.测量的数据及研究意义
测定了LeYC36与黑曲霉、青霉共培养时的真菌CFU数，数据来自图1A。意义：直接证明α-萜品烯能显著增强LeYC36对两种真菌的抑制作用。
测定了有无α-萜品烯条件下LeYC36的生长曲线，数据来自图1B。意义：证明α-萜品烯本身不影响LeYC36的生长，排除了生长增强导致抗真菌活性提高的可能性。
测定了α-萜品烯单独处理时黑曲霉和青霉的生长情况，数据来自图1C。意义：证明α-萜品烯本身无抗真菌活性，其作用是通过调控LeYC36实现的。
测定了发酵后添加α-萜品烯的上清液的抑菌圈直径，数据来自图1D、E。意义：证明α-萜品烯不能直接增强已有抗真菌物质的活性，而是通过诱导LeYC36合成更多抗真菌物质发挥作用。
测定了发酵过程中添加α-萜品烯的上清液的抑菌圈直径，数据来自图1F、G。意义：进一步验证α-萜品烯通过诱导LeYC36产生抗真菌物质增强其抑菌能力。
测定了α-萜品烯处理前后LeYC36的转录组差异，数据来自图2A。意义：筛选出α-萜品烯诱导上调的关键基因，包括抗真菌效应物基因、生物膜合成基因和双组分系统基因，为后续机制研究指明方向。
通过qPCR验证了LegluB基因的上调表达，数据来自图2B。意义：在转录水平确认α-萜品烯能显著诱导GluB的合成。
测定了LeΔgluB突变体发酵上清液的抑菌圈直径，数据来自图2C、D、E。意义：证明GluB是α-萜品烯增强LeYC36抗真菌活性的关键效应物之一。
通过qPCR验证了Lehsaf基因的上调表达，数据来自图2F。意义：在转录水平确认α-萜品烯能显著诱导HSAF合成关键基因的表达。
通过HPLC测定了有无α-萜品烯条件下HSAF的产量，数据来自图2G。意义：在蛋白水平直接证明α-萜品烯能显著提高HSAF的合成量。
测定了LeΔhsaf突变体发酵上清液的抑菌圈直径，数据来自图2H。意义：证明HSAF是LeYC36抗真菌活性的核心效应物，且是α-萜品烯调控的主要靶点。
通过结晶紫染色法测定了有无α-萜品烯条件下LeYC36的生物膜产量，数据来自图3A。意义：证明α-萜品烯能显著促进LeYC36的生物膜形成。
比对了LeYC36与铜绿假单胞菌PAO1的psl基因簇，数据来自图3B。意义：鉴定出LeYC36中负责生物膜合成的Lepsl基因簇，为后续基因功能研究奠定基础。
测定了LeΔpslA、LeΔpslD、LeΔpslE突变体的生物膜产量，数据来自图3C。意义：证明这三个基因是LeYC36生物膜合成的关键基因，且是α-萜品烯调控生物膜形成的靶点。
通过qPCR验证了LepslA、LepslD、LepslE基因的上调表达，数据来自图3D。意义：在转录水平确认α-萜品烯能诱导生物膜合成基因的表达。
通过qPCR验证了双组分系统基因LeczcS、LeczcR、LedesK、LedesR的上调表达，数据来自图4A。意义：筛选出可能参与α-萜品烯信号感知的双组分系统。
测定了LeΔczcS和LeΔdesK突变体的生物膜产量，数据来自图4B。意义：证明LeCzcS参与α-萜品烯调控生物膜形成的过程，而LeDesK不参与。
测定了LeΔczcS和LeΔdesK突变体发酵上清液的抑菌圈直径，数据来自图4C、D。意义：证明LeCzcS参与α-萜品烯调控抗真菌活性的过程，而LeDesK不参与。
测定了LeΔczcS和LeΔczcR突变体的生长曲线，数据来自图4E。意义：证明LeCzcS和LeCzcR基因的敲除不影响LeYC36的基本生长，排除了生长缺陷导致表型变化的可能性。
通过BLI测定了LeCzcS与不同浓度α-萜品烯的结合亲和力，数据来自图4F。意义：直接证明LeCzcS能以浓度依赖的方式特异性结合α-萜品烯，是α-萜品烯的受体蛋白。
测定了LeΔczcR突变体的生物膜产量，数据来自图4G。意义：证明LeCzcR是α-萜品烯调控生物膜形成的响应调节因子。
测定了LeΔczcR突变体发酵上清液的抑菌圈直径，数据来自图4H、I、J。意义：证明LeCzcR是α-萜品烯调控抗真菌活性的响应调节因子。
通过qPCR测定了LeΔczcS和LeΔczcR突变体中下游基因的表达水平，数据来自图5A、B、C、D、E。意义：证明LeCzcS/LeCzcR系统是α-萜品烯诱导下游抗真菌效应物和生物膜合成基因表达的必需条件。
测定了LeΔczcS::czcS和LeΔczcR::czcR回补菌株的生物膜产量，数据来自图5F。意义：从遗传学上验证LeCzcS和LeCzcR的功能，回补后菌株恢复了对α-萜品烯的响应。
测定了LeΔczcS::czcS和LeΔczcR::czcR回补菌株发酵上清液的抑菌圈直径，数据来自图5G。意义：进一步验证LeCzcS/LeCzcR系统在α-萜品烯信号通路中的核心作用。
通过EMSA证明磷酸化LeCzcR能直接结合Lehsaf、LegluB和Lepsl的启动子，数据来自图5H、I、J。意义：在分子水平证明LeCzcR通过直接结合下游基因启动子调控其表达。
通过EMSA证明LeCzcR D51A突变体不能结合下游基因启动子，数据来自图5K。意义：确定Asp51是LeCzcR的关键磷酸化位点，磷酸化是其发挥转录调控功能的前提。
测定了LeYC36及其突变体与禾谷镰孢共培养时的真菌CFU数，数据来自图5L。意义：验证LeCzcS/LeCzcR系统在天然细菌-真菌互作中发挥重要作用，感知真菌产生的α-萜品烯并增强抗真菌活性。
绘制了α-萜品烯介导的信号通路机制图，数据来自图6。意义：系统总结了本研究发现的调控机制，直观展示了从信号感知到下游效应的完整过程。
8.结论
本研究系统阐明了真菌衍生信号α-萜品烯调控产酶溶杆菌YC36抗真菌活性和生物膜形成的分子机制。LeYC36通过双组分系统LeCzcS/LeCzcR感知环境中的α-萜品烯，其中传感器激酶LeCzcS作为受体直接结合α-萜品烯并发生自磷酸化，随后将磷酸基团转移给响应调节因子LeCzcR。磷酸化的LeCzcR通过其保守的Asp51位点激活，直接结合下游抗真菌效应物基因Lehsaf、LegluB和生物膜合成基因LepslA/D/E的启动子区域，促进这些基因的转录表达。最终，LeYC36通过增加HSAF和GluB的合成增强对真菌的杀伤能力，同时通过促进生物膜形成提高自身的环境适应性和防御能力，从而在细菌-真菌互作中占据竞争优势。该研究揭示了微生物跨界化学交流的新机制，为利用微生物信号分子开发高效、环保的生物防治技术提供了重要的理论基础和潜在应用靶点。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C Pro全自动微生物生长曲线分析仪，在96孔板中高通量测定了野生型LeYC36、LeΔczcS、LeΔczcR等菌株在有无0.1 μM α-萜品烯条件下的生长曲线，培养温度为28℃，每小时自动测定一次600 nm处的光密度值，连续监测24小时，每个样品设置3个生物学重复。这些生长曲线数据的研究意义主要体现在以下几个方面：
排除生长因素对实验结果的干扰：这是生长曲线数据最核心的作用。通过测定有无α-萜品烯条件下LeYC36的生长曲线（图1B），证明α-萜品烯本身不影响细菌的生长速率和最大生物量，从而排除了“α-萜品烯通过促进细菌生长来增强抗真菌活性”的可能性。同时，测定LeΔczcS和LeΔczcR突变体的生长曲线（图4E），证明这两个基因的敲除不会导致细菌生长缺陷，确保后续观察到的抗真菌活性下降和生物膜形成减少是由于信号通路阻断引起的，而非细菌生长能力下降导致的，为实验结果的可靠性提供了关键保障。
实现高通量、标准化的生长动力学测定：Bioscreen仪器可同时处理96个样品，本研究中对多个菌株、多个处理条件及生物学重复进行了同步培养和监测，在24小时内完成了所有生长实验。与传统的摇瓶培养和人工定时取样测定相比，极大提高了实验效率，减少了人工操作带来的误差。仪器的标准化培养条件（恒温、连续均匀振荡、均一的培养体系）保证了不同菌株、不同条件之间生长数据的可比性，为准确评估基因功能和外源信号的影响提供了标准化的平台。
精确获取生长动力学参数：通过连续监测OD600的动态变化，可以精确计算各菌株的延迟期、对数生长期的比生长速率、稳定期的最大生物量等关键生长动力学参数。这些参数不仅能直观反映细菌的生长状态，还能为后续的生理实验（如发酵时间的确定、接种量的优化）和生物防治应用中的发酵工艺开发提供基础数据。例如，根据生长曲线确定LeYC36的对数生长期，为转录组取样和蛋白表达实验提供了准确的时间点。
为基因功能验证提供基础表型数据：生长曲线是微生物基因功能研究的基础表型。本研究中，通过对比野生型和突变体的生长曲线，确认了LeCzcS和LeCzcR不是细菌基本生长所必需的基因，其功能主要是参与环境信号的感知和响应。这为后续研究这些基因在信号通路中的特异性作用奠定了基础，避免了将基本生长必需基因的表型误判为信号通路相关表型。
为生物防治应用提供参考依据：生防细菌的生长适应性是其田间应用效果的关键因素。Bioscreen测定的生长数据可以用于评估LeYC36及其工程化菌株在不同环境条件下的生长能力，为其发酵培养基优化、发酵工艺参数设定以及田间施用条件的选择提供参考。同时，验证α-萜品烯不影响LeYC36的生长，也为后续开发“信号分子+生防细菌”的复合生物防治剂提供了安全性和可行性依据。