Non-traditional yeasts from cool-climate vineyards for novel low-alcohol wines
来自冷气候葡萄园的非传统酵母，用于新型低酒精葡萄酒
来源：Plants People Planet. 2025;7:776–788.
1.摘要
近年来，利用能反映葡萄种植区微生物风土的非传统酵母发酵葡萄酒受到广泛关注。这些本土酵母栖息于葡萄果皮，可产生独特风味，与传统酿酒酵母配合使用还能降低发酵不完全的风险，同时能酿造出酒精含量相对较低的葡萄酒，契合健康消费趋势。本研究从加拿大新斯科舍省葡萄园的L'Acadie和黑比诺葡萄中分离酵母，通过DNA测序鉴定菌株，并对其发酵特性进行表征。基于乙醇和二氧化硫耐受性、β-葡萄糖苷酶活性及低硫化氢产生能力，筛选出葡萄汁酵母（*Saccharomyces uvarum*）、葡萄汁有孢汉逊酵母（*Hanseniaspora uvarum*）、异常威克汉姆酵母（*Wickerhamomyces anomalus*）和佛罗伦萨接合酵母（*Zygotorulaspora florentina*）的优良菌株，与酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）进行混合和顺序发酵。结果显示，多数含非传统酵母的发酵组酒精含量显著低于纯传统酵母组，果糖残留量更高，总酚含量相近；专业品鉴小组发现这些发酵酒样具有新颖的水果和花香属性。本研究表明，冷气候产区的本土酵母可与传统酵母协同使用，生产出发酵失败风险低、风味独特的低酒精葡萄酒，挖掘了当地天然酵母资源打造地域特色葡萄酒的潜力。
2.关键词（中文）
低酒精葡萄酒、混合发酵、本土酵母、非传统酵母、葡萄汁酵母、顺序发酵、葡萄园酵母
3.研究目的
一是系统分离、鉴定和表征北美冷气候（加拿大新斯科舍省）葡萄园的本土酵母资源，填补该区域非传统酿酒酵母研究的空白；二是筛选出兼具良好发酵耐受性（乙醇、SO₂）、低不良代谢产物（H₂S）和风味贡献潜力（酶活性）的优良菌株；三是优化混合和顺序发酵工艺参数（接种时间、菌株比例），在保证发酵完全性的前提下，显著降低葡萄酒酒精含量；四是通过专业感官评价和化学分析，评估本土酵母发酵葡萄酒的品质特性，开发具有地域特色的新型低酒精葡萄酒；五是为冷气候葡萄酒产业提供可商业化应用的本土酵母菌株和发酵技术方案。
4.研究思路
首先从新斯科舍省多个葡萄园的成熟L'Acadie和黑比诺葡萄中采集样品，通过平板分离和自发发酵分离获得122株酵母菌株；采用ITS区域PCR扩增和Sanger测序对菌株进行分子鉴定，明确物种组成；随后对菌株进行系统的发酵特性表征，包括利用Bioscreen C MBR测定不同乙醇浓度下的生长曲线，评估酒精耐受性，同时测定SO₂耐受性、β-葡萄糖苷酶活性、蛋白酶活性和H₂S产生能力；基于筛选指标选出6株优良菌株（3株*S. uvarum*和3株非酿酒酵母），设计三组发酵实验：*S. uvarum*顺序发酵（第7/14天接种酿酒酵母）、*S. uvarum*与酿酒酵母混合发酵（1:1和100:1比例）、非酿酒酵母顺序发酵（第4/7天接种酿酒酵母），以纯酿酒酵母发酵为对照；发酵结束后，采用FOSS WineScan、HPLC和Folin–Ciocalteu法测定葡萄酒的酒精、糖、甘油、总酚、pH和总酸度等理化指标；最后组织15名经验丰富的品鉴人员，采用CATA法进行感官评价，通过对应分析可视化不同样品的感官特征差异，综合评估发酵效果。
5.研究亮点
一是首次系统开展了加拿大新斯科舍省冷气候葡萄园本土酵母的资源调查和应用研究，分离鉴定出11个属的酵母，丰富了冷气候酿酒酵母资源库；二是筛选出多株性能优良的本土菌株，其中*S. uvarum*菌株酒精耐受性高达15%，SO₂耐受性达60 mg/L，与商业酿酒酵母相当，且具有低H₂S产生和风味酶活性；三是建立了适配冷气候产区的低酒精葡萄酒发酵工艺，通过混合/顺序发酵实现了酒精含量最高27%的降低（从11.3%降至7.9%），同时保留了葡萄酒的总酚含量；四是揭示了接种比例对发酵效果的关键影响，发现*S. uvarum*与酿酒酵母100:1的混合比例能显著提升葡萄酒的花果香，而1:1比例更接近传统酵母风味；五是通过专业感官评价验证了本土酵母的风味优势，证明其能赋予葡萄酒柑橘、苹果、热带水果、花香等新颖属性，弥补了低酒精葡萄酒风味不足的短板；六是明确了不同非酿酒酵母的风味贡献差异，其中*Z. florentina*发酵的葡萄酒风味最稳定且最受好评，具有极高的商业化潜力。
6.可延伸方向
一是深入研究优良本土菌株的种内差异，通过全基因组测序和代谢组学分析，揭示不同菌株发酵特性和风味产生的分子机制；二是优化发酵工艺参数，包括发酵温度、pH、氮源添加量和接种量，进一步提升低酒精葡萄酒的品质和发酵效率；三是探索本土酵母与不同冷气候葡萄品种（如雷司令、霞多丽、品丽珠）的适配性，开发系列特色低酒精葡萄酒产品；四是开展本土酵母的商业化开发，通过诱变育种和基因工程改良菌株性能，制备标准化的商业酵母制剂；五是研究本土酵母发酵对葡萄酒抗氧化活性、营养成分和保质期的影响，全面评估产品的健康价值和稳定性；六是结合合成生物学技术，构建能精准调控酒精含量和风味的工程酵母菌株，实现低酒精葡萄酒的定制化生产；七是开展大规模工业发酵试验，验证实验室工艺的放大可行性，建立配套的生产技术规范。
7.测量的数据及研究意义
测定了7株酵母（3株*S. uvarum*、3株非酿酒酵母和1株商业酿酒酵母）在0%-20%乙醇浓度下的生长OD值和相对生长率，数据来自表1。意义：定量评估了各菌株的酒精耐受性，筛选出能适应葡萄酒发酵高酒精环境的菌株，为后续发酵实验的菌株选择提供了核心依据，其中*S. uvarum*菌株高达15%的酒精耐受性证明其适合与酿酒酵母协同发酵。
测定了6株筛选菌株的SO₂耐受性（0-60 mg/L）、H₂S产生能力、β-葡萄糖苷酶和蛋白酶活性，数据来自表2。意义：全面评估了菌株的发酵安全性和风味贡献潜力，SO₂耐受性保证了菌株能在常规葡萄酒杀菌条件下存活，低H₂S产生避免了臭鸡蛋味等不良风味，β-葡萄糖苷酶和蛋白酶活性则预示了菌株能通过水解糖苷和蛋白质释放更多风味物质。
测定了*S. uvarum*顺序发酵（第7/14天接种酿酒酵母）葡萄酒的总酚、酒精、甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖、pH和总酸度，数据来自表3。意义：证明*S. uvarum*顺序发酵能在不显著影响总酚含量的前提下，将酒精含量从11.3%降至8.9%-10.2%，同时保留了适量的果糖，为葡萄酒带来甜味，平衡了酸度。
测定了*S. uvarum*与酿酒酵母不同比例（1:1和100:1）混合发酵葡萄酒的上述理化指标，数据来自表4。意义：揭示了接种比例对发酵效果的显著影响，100:1比例能将酒精含量进一步降至8.2%，而1:1比例的酒精含量与传统酵母接近，为通过调整比例精准控制酒精含量提供了依据。
测定了3株非酿酒酵母顺序发酵（第4/7天接种酿酒酵母）葡萄酒的上述理化指标，数据来自表5。意义：证明非酿酒酵母同样能有效降低酒精含量（最低至6.9%），其中*Z. florentina*发酵的葡萄酒残留葡萄糖最高，甜味最明显，为开发不同甜度的低酒精葡萄酒提供了选择。
测定了三组发酵实验所有酒样的感官属性频率，并通过对应分析展示了样品与感官属性的关联，数据来自图1a、图1b、图1c。意义：直观可视化了不同酵母组合的感官特征差异，明确了本土酵母能赋予葡萄酒花果香、甜味等愉悦属性，而传统酵母则偏向苦涩、矿物味，为产品的风味定位和市场推广提供了直接依据。
8.结论
本研究从加拿大新斯科舍省冷气候葡萄园分离鉴定出11个属的本土酵母，筛选出6株兼具良好发酵耐受性和风味贡献潜力的优良菌株。通过混合和顺序发酵工艺，成功实现了葡萄酒酒精含量的显著降低（最高27%），同时保留了总酚含量，并赋予葡萄酒新颖的水果和花香属性。其中，*S. uvarum*与酿酒酵母100:1混合发酵和*Z. florentina*顺序发酵表现最佳，生产的葡萄酒具有柑橘、苹果、热带水果、花香等愉悦风味，且发酵失败风险低。研究结果表明，冷气候产区的本土酵母资源具有巨大的开发潜力，可用于生产具有地域特色的新型低酒精葡萄酒，既能满足消费者对健康饮品的需求，又能帮助葡萄酒产业应对气候变暖导致的葡萄含糖量升高问题，为冷气候葡萄酒产业的可持续发展提供了新的技术路径和方向。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C MBR全自动微生物生长曲线分析仪测定了所有分离酵母菌株在0%-20%梯度乙醇浓度下的生长曲线，数据是表1中酒精耐受性结果的基础。该仪器通过每小时自动测定450-580 nm宽波段光密度，连续监测72小时，获得了完整的酵母生长动力学数据，其研究意义主要体现在以下几个方面：
高通量快速筛选酒精耐受性菌株：Bioscreen可同时处理多达200个样品，本研究中对122株初始分离菌株进行了酒精耐受性初筛，随后对7株重点菌株进行了10个乙醇浓度的梯度测试，每个浓度设置4个生物学重复。这种高通量能力大大缩短了筛选周期，在短时间内从大量菌株中快速鉴定出酒精耐受性符合要求的候选菌株，避免了传统试管培养法的低效率和高误差。
精确量化生长动力学参数：仪器自动记录了每个菌株在不同酒精浓度下的延迟期长度、对数生长期生长速率和最大OD值等关键动力学参数。通过这些参数，不仅能定性判断菌株能否在某一酒精浓度下生长，还能定量比较不同菌株的生长活力差异。例如，本研究发现*S. uvarum* 114256-2在8%乙醇浓度下仍能保持97.9%的相对生长率，而*W. anomalus*在5%乙醇浓度下生长率已降至2.49%，这种精确量化为菌株的最终筛选提供了客观数据支持。
模拟葡萄酒发酵的酒精胁迫环境：葡萄酒发酵过程中酒精浓度会从0逐渐升高至12%-15%，Bioscreen的梯度乙醇浓度设置（0%-20%）完美模拟了这一动态胁迫过程。通过测定不同酒精浓度下的生长曲线，能准确预测菌株在实际发酵中的存活和增殖能力，确保筛选出的菌株能在发酵全程保持活性，避免因酒精耐受性不足导致的发酵停滞或不完全。
保证实验数据的标准化和重复性：仪器的自动化操作（自动加样、自动孵育、自动振荡、自动读数）消除了人工操作带来的随机误差，统一的培养条件（温度、振荡速度、通气量）保证了不同菌株和不同批次实验结果的可比性。本研究中所有酒精耐受性实验均在25℃下进行，每小时读数前振荡20秒，严格标准化的实验条件确保了表1中数据的可靠性和可重复性。
为后续发酵工艺优化提供依据：基于Bioscreen测定的酒精耐受性数据，本研究设计了合理的混合和顺序发酵方案。例如，由于*S. uvarum*酒精耐受性较高，采用了先发酵7-14天再接种酿酒酵母的顺序发酵；而*H. uvarum*和*W. anomalus*酒精耐受性较低，将接种酿酒酵母的时间提前至第4-7天，确保了发酵的顺利进行。同时，生长速率数据也为确定最佳接种量和发酵时间提供了重要参考。