Functional expression of a Mo-dependent formate dehydrogenase in Escherichia coli under aerobic conditions
大肠杆菌在需氧条件下的功能性表达Mo依赖型甲酸脱氢酶
来源：PLoS One 20(10):e0334613
1.摘要
耐氧的复杂金属依赖型甲酸脱氢酶在生物技术领域具有潜在应用价值。本研究报道了在大肠杆菌中功能性表达来自贪铜菌（Cupriavidus necator）的fdsGBACD操纵子编码的复杂钼依赖型可溶性甲酸脱氢酶（CnFDH）。通过质粒或染色体整合方式表达该操纵子，能够使能量营养缺陷型筛选菌株在有氧条件下以甲酸为唯一能源生长。在恒浊器中进行连续培养可加速生长，使世代时间缩短1小时。对进化分离株的测序发现，其操纵子序列未发生突变，但所有测序菌株中编码双向甲酸转运蛋白的focA基因均存在非同义点突变。回复突变导致生长速率下降，证明focA基因是连续培养适应的主要靶点。该研究表明，耐氧亚型的复杂甲酸脱氢酶在异源宿主大肠杆菌（生物技术模式生物）中表达时具有稳定的甲酸氧化活性，操纵子的染色体整合为通过体内诱变进行结构/功能研究和活性增强提供了可能，也可在合适的筛选宿主中应用于CO₂还原。
2.关键词（中文）
甲酸脱氢酶、钼依赖型、大肠杆菌、需氧表达、甲酸转运、focA、连续培养
3.研究目的
一是验证耐氧的复杂钼依赖型甲酸脱氢酶能否在大肠杆菌中实现异源功能性表达，并在有氧条件下支持以甲酸为唯一能源的细胞生长；二是通过连续培养适应性进化提高菌株的甲酸依赖型生长速率，鉴定影响生长的关键适应性突变及其作用机制；三是构建染色体整合的稳定表达菌株，为后续的酶结构功能研究、体内定向进化以及CO₂生物还原应用提供可靠平台。
4.研究思路
首先从贪铜菌基因组中克隆fdsGBACD操纵子（包含3个酶亚基基因和2个必需分子伴侣基因），构建基于pTrc99a的诱导型表达质粒；将质粒转化至缺失lpd基因的大肠杆菌能量营养缺陷型菌株（Δlpd），该菌株在以乙酸为唯一碳源时需要额外能量来源，以此验证CnFDH能否通过氧化甲酸产生NADH支持生长；随后采用恒浊器连续培养系统对菌株进行适应性进化，筛选生长速率更快的突变株；对进化菌株进行全基因组测序，鉴定所有突变位点，并通过等位基因交换实验验证关键突变（如focA）对生长的影响；进一步将fdsGBACD操纵子整合至大肠杆菌染色体的IS10位点，构建无质粒的稳定表达菌株，并通过CRISPR干扰技术验证其功能；最后通过酶活测定、RT-qPCR转录分析、次磷酸盐毒性实验和甲酸分泌实验，探究适应性进化提高生长速率的分子机制。
5.研究亮点
一是首次在大肠杆菌中实现了复杂多亚基钼依赖型甲酸脱氢酶的有氧功能性表达，证明其在有氧环境中能稳定催化甲酸氧化并产生NADH，突破了传统金属依赖型FDH氧敏感的限制，为需氧条件下的CO₂生物转化奠定了基础；二是通过连续培养进化将菌株的世代时间从约4小时40分钟缩短至2小时15分钟，且所有独立进化的菌株均在focA基因上发生了非同义突变，首次揭示了甲酸转运是限制大肠杆菌利用甲酸生长的关键瓶颈；三是构建了染色体整合的稳定表达菌株，避免了质粒的不稳定性和抗生素筛选压力，为长期连续进化和体内定点诱变研究提供了理想平台；四是发现进化背景不仅能提高CnFDH的活性（10倍），还能增强非金属依赖型硫杆菌FDH的活性（2倍），表明适应性突变通过改善辅因子成熟、蛋白折叠或底物供应等通用机制提升了异源酶的功能。
6.可延伸方向
一是利用染色体整合的稳定菌株进行体内定向进化，结合高通量筛选技术进一步提高CnFDH的甲酸氧化活性和CO₂还原活性；二是通过结构生物学和定点诱变研究FocA突变体在有氧条件下调控甲酸转运的分子机制，解析其底物选择性和转运效率的结构基础；三是将CnFDH与合成的CO₂还原途径（如还原性甘氨酸途径）偶联，构建能以CO₂和甲酸为唯一碳源生长的自养型大肠杆菌；四是优化钼辅因子和铁硫簇的生物合成途径，提高异源CnFDH的成熟效率和比活；五是测试CnFDH在其他工业微生物（如谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母）中的表达和功能，拓展其在生物制造和碳循环中的应用范围；六是开发基于该FDH的高效NADH再生系统，应用于手性化合物的生物催化合成。
7.测量的数据及研究意义
测定了Δlpd菌株和携带pTRC-CnFDH质粒的Δlpd菌株在不同碳源和能量源组合下的生长曲线，数据来自图1。意义：直接证明了CnFDH的功能性表达能使能量营养缺陷型大肠杆菌在有氧条件下以甲酸为唯一能源生长，且丙酮酸的添加能显著促进生长。
测定了两个独立恒浊器培养（UOF1和UOF2）中菌株世代时间随培养天数的变化，数据来自图2。意义：直观展示了连续培养能显著加速菌株的甲酸依赖型生长，经过约230-380代进化后，世代时间稳定缩短约1小时25分钟。
测定了原始进化株G5823、质粒消除株G5876和质粒回补株G6504的生长曲线，数据来自图3。意义：验证了进化菌株的生长完全依赖于质粒携带的CnFDH，排除了染色体突变独立支持生长的可能性。
测定了携带focA突变的进化株及其focA野生型回复株的生长曲线，数据来自图4。意义：直接证明了focA基因的非同义突变是导致进化菌株生长速率提高的关键因素。
测定了不同菌株在厌氧条件下对次磷酸盐的敏感性，数据来自图5。意义：表明进化菌株中的focA突变增强了甲酸的摄取能力，从而提高了胞内甲酸的可用性。
测定了不同菌株厌氧发酵葡萄糖时的甲酸分泌量，数据来自图6。意义：发现所有进化菌株的甲酸分泌量均显著低于未进化菌株，说明进化过程中还发生了其他突变，减少了甲酸的外流，进一步提高了胞内甲酸利用率。
测定了CnFDH和硫杆菌FDH在进化背景和未进化背景下的生长曲线，数据来自图7。意义：证明进化背景对不同类型的FDH（金属依赖型和非依赖型）均有生长促进作用，提示其作用机制具有普遍性。
测定了不同菌株细胞裂解液中FDH的比活性，数据来自图8。意义：定量证实了进化背景能显著提高异源FDH的酶活性，且对CnFDH的提升效果更显著。
测定了CRISPRi沉默fdsGBACD操纵子后菌株在不同培养基上的生长情况，数据来自图9。意义：验证了染色体整合的CnFDH是菌株在甲酸培养基上生长所必需的，排除了其他潜在途径的干扰。
测定了质粒表达和染色体整合CnFDH的菌株生长曲线，数据来自图10。意义：比较了两种表达方式的生长效率，发现多拷贝质粒表达的生长速率更快，但染色体整合更稳定。
测定了不同菌株中fdsG、fdsA和fdsD基因的相对转录水平，数据来自表2。意义：分析了遗传背景和表达方式对FDH基因转录的影响，发现进化背景下转录水平略有下降，但酶活显著提高，提示翻译后修饰或辅因子成熟是主要限制因素。
测定了6株进化菌株的全基因组序列，鉴定了所有突变位点，数据来自S1文件。意义：全面揭示了连续培养过程中发生的适应性突变，为后续机制研究提供了靶点。
8.结论
本研究成功在大肠杆菌中实现了贪铜菌来源的复杂钼依赖型甲酸脱氢酶的有氧功能性表达，证明该酶能在有氧环境中稳定催化甲酸氧化并为细胞生长提供能量。通过恒浊器连续培养适应性进化，将菌株的甲酸依赖型生长速率提高了约1.9倍，且所有进化菌株均在编码甲酸转运蛋白的focA基因上发生了非同义突变，结合次磷酸盐毒性和甲酸分泌实验，证实了甲酸转运是限制生长的关键因素。进一步将fdsGBACD操纵子整合至大肠杆菌染色体，构建了无质粒的稳定表达菌株，并通过CRISPRi验证了其功能。该研究不仅为理解异源金属酶的表达和调控提供了新见解，也为开发基于耐氧FDH的CO₂生物还原技术和高效NADH再生系统奠定了坚实基础。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中所有需氧条件下的细菌生长曲线均使用芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪测定，数据分别来自图1、图3、图4、图7和图10。该仪器通过每隔15分钟自动测定600 nm处的光密度（OD₆₀₀），连续监测120小时，获得了完整的细菌生长动力学曲线，其研究意义主要体现在以下几个方面：
核心表型的定量验证：本研究的核心是验证CnFDH能否在大肠杆菌中功能性表达并支持甲酸依赖型生长，Bioscreen的生长曲线数据是最直接、最可靠的表型证据。图1的生长曲线清晰地显示，只有同时携带CnFDH质粒和添加甲酸时，Δlpd菌株才能生长，无可辩驳地证明了CnFDH的功能。
生长动力学参数的精确测定：Bioscreen能自动记录整个生长周期的OD值，从而精确计算出菌株的延迟期、对数生长期、稳定期以及世代时间等关键动力学参数。通过比较不同菌株的世代时间，本研究定量评估了连续培养进化的效果（世代时间从4h40缩短至2h15）、focA突变的贡献以及不同表达方式的效率差异。
高通量平行实验的标准化：Bioscreen可同时处理100个样品，本研究中所有生长实验均设置了三个生物学重复，仪器的自动化操作和均一的培养条件（温度、振荡速度）确保了实验结果的高度重复性和可比性，避免了人工操作带来的误差。
多条件对比的高效实现：本研究通过Bioscreen同时比较了不同碳源组合、不同菌株背景、不同表达方式和不同基因突变对生长的影响，在短时间内获得了大量高质量的生长数据，为快速筛选和验证关键因素提供了可能。
排除间接干扰因素：通过测定不同浓度化合物或不同遗传背景下的生长曲线，可以排除非特异性因素对实验结果的干扰。例如，本研究通过生长曲线证明了focA突变不影响细菌在葡萄糖培养基上的生长，其促进作用是特异性针对甲酸依赖型生长的。
为后续实验提供基础：Bioscreen获得的生长动力学数据为连续培养的参数设置、酶活测定的取样时间点选择以及体内进化的周期规划提供了重要的参考依据，确保了后续实验的科学性和有效性。