Exploring daidzein dimethyl ether from Albizzia lebbeck as a novel quorum sensing inhibitor against Pseudomonas aeruginosa: Insights from in vitro and in vivo studies
探索来自合欢的大豆苷元二甲醚作为抗铜绿假单胞菌的新型群体感应抑制剂：体外及体内研究的见解
来源：Bioorganic Chemistry 156 (2025) 108168
1.摘要
多重耐药病原体包括铜绿假单胞菌的感染在免疫功能低下患者中导致高死亡率，凸显了对新型天然抗菌药物的迫切需求。本研究证明了果蔬中常见的植物化学物质具有抑制铜绿假单胞菌PAO1群体感应的能力。通过分子对接技术虚拟筛选了10种化合物，其中源自合欢的大豆苷元二甲醚对PA的生物膜形成以及弹性蛋白酶、绿脓素和鼠李糖脂等毒力因子的积累表现出最显著的抑制作用。进一步通过qRT-PCR分析PA中关键群体感应组分（包括LasR）以及异源系统中LasR报告基因的发光检测，发现10 µM的大豆苷元二甲醚显著抑制lasR及其下游靶基因的转录。同时，分子动力学模拟表明大豆苷元二甲醚可降低LasR蛋白的稳定性。此外，利用斑马鱼感染模型证明了大豆苷元二甲醚对PA感染的保护作用，发现其通过显著抑制活性氧（ROS）积累和降低斑马鱼幼虫死亡率，显著减轻PA感染斑马鱼的炎症反应并提高其存活率。旷场实验显示PA感染的斑马鱼出现游泳行为受损，但大豆苷元二甲醚处理可有效挽救这种异常。组织病理学分析表明，与仅用PA处理的斑马鱼相比，同时用PA和大豆苷元二甲醚处理的斑马鱼肠道组织保持明显的结构完整性。本研究首次在动物模型中证明了大豆苷元二甲醚对PA感染的预防优势，值得进一步探索其作为抗菌剂的潜在治疗干预价值。
2.关键词（中文）
铜绿假单胞菌、群体感应、虚拟筛选、大豆苷元二甲醚、LasR
3.研究目的
一是从10种植物化学物质中筛选出能有效抑制铜绿假单胞菌生物膜形成和毒力因子产生的群体感应抑制剂；二是探究筛选出的大豆苷元二甲醚影响群体感应相关基因表达的分子机制，重点关注其对关键群体感应调节因子LasR的抑制作用；三是在体内斑马鱼模型中全面评估大豆苷元二甲醚对铜绿假单胞菌感染的保护作用，包括其对炎症反应、存活率和感染相关行为变化的影响。
4.研究思路
首先以铜绿假单胞菌的关键群体感应调节蛋白LasR为靶点，通过分子对接技术从植物化学物质库中虚拟筛选出10种潜在的群体感应抑制剂；接着使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定这10种化合物对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度（MIC）和生长曲线，确定不影响细菌生长的实验浓度；然后在体外评估这些化合物对铜绿假单胞菌生物膜形成以及弹性蛋白酶、绿脓素、蛋白酶、鼠李糖脂等毒力因子产生的抑制作用，筛选出效果最显著的大豆苷元二甲醚；随后通过qRT-PCR分析大豆苷元二甲醚对群体感应相关基因lasR和rhlR表达的影响，构建大肠杆菌报告菌株测定其对LasR的半数抑制浓度（IC50），并利用分子动力学模拟探究其与LasR的相互作用机制；最后建立斑马鱼感染模型，从幼虫和成年鱼两个层面，评估大豆苷元二甲醚对铜绿假单胞菌感染的保护作用，检测指标包括ROS水平、细胞死亡、存活率、游泳行为和肠道组织病理学变化等。
5.研究亮点
一是首次发现并系统验证了源自合欢的大豆苷元二甲醚是一种新型高效的铜绿假单胞菌群体感应抑制剂，其对LasR的IC50低至9.413 µM，在10 µM浓度下即可显著抑制47.67%的生物膜形成和多种毒力因子产生；二是采用了体外分子机制研究与体内动物实验相结合的完整研究体系，不仅从分子水平阐明了大豆苷元二甲醚通过降低LasR稳定性来抑制群体感应的作用机制，还在斑马鱼模型中全面验证了其抗感染保护效果；三是证明了大豆苷元二甲醚在不抑制细菌生长的前提下发挥抗感染作用，避免了传统抗生素诱导耐药性的风险，为多重耐药铜绿假单胞菌感染的治疗提供了全新策略；四是首次在动物模型中证明了大豆苷元二甲醚对铜绿假单胞菌感染的多维度保护优势，包括减轻炎症、提高存活率、挽救异常游泳行为和保护肠道组织完整性等。
6.可延伸方向
一是开展大豆苷元二甲醚与传统抗生素的联合用药研究，评估其协同抗菌效果，探索降低抗生素使用剂量、减少耐药性产生的可能性；二是对大豆苷元二甲醚进行结构修饰和改造，优化其与LasR的结合亲和力和生物利用度，进一步提高其群体感应抑制活性；三是在更接近人类的哺乳动物模型（如小鼠肺部感染模型）中进一步验证大豆苷元二甲醚的体内抗感染效果和长期安全性；四是探究大豆苷元二甲醚对铜绿假单胞菌其他群体感应系统（如Rhl、PQS、IQS）的影响，全面阐明其作用机制网络；五是开发大豆苷元二甲醚的合适制剂（如纳米制剂、吸入制剂），提高其在感染部位的局部浓度和生物利用度；六是评估大豆苷元二甲醚对其他致病菌群体感应系统的抑制作用，拓展其抗菌谱和应用范围。
7.测量的数据及研究意义
测定了10种化合物与LasR蛋白的对接得分、相互作用类型及结合的氨基酸残基，数据来自表4和图S1。意义：初步筛选出与LasR具有高结合亲和力的潜在群体感应抑制剂，为后续体外实验提供了明确的候选化合物。
使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定了10种化合物在10-160 µM浓度下对铜绿假单胞菌生长的影响，数据来自图S3和图3A、B。意义：确定了这些化合物在实验浓度下不抑制细菌生长，证明其作用机制是特异性抑制群体感应而非直接杀菌，从根本上避免了诱导细菌产生耐药性的风险。
通过结晶紫染色法和共聚焦激光扫描显微镜测定了化合物对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用，数据来自图3C、D。意义：定量和定性地证明了大豆苷元二甲醚等化合物能显著破坏生物膜结构，而生物膜是铜绿假单胞菌产生耐药性和导致慢性感染的核心原因。
测定了化合物对弹性蛋白酶、绿脓素、蛋白酶和鼠李糖脂等毒力因子产生的抑制作用，数据来自图3E、F、G、H。意义：证明了这些化合物能同时抑制多种由群体感应调控的毒力因子，全面减弱铜绿假单胞菌的致病性和侵袭能力。
测定了大豆苷元二甲醚对lasR和rhlR基因表达的影响，数据来自图4A。意义：从转录水平证实了大豆苷元二甲醚能显著下调关键群体感应调节基因lasR的表达，为阐明其分子作用机制提供了直接证据。
构建大肠杆菌报告菌株，测定了大豆苷元二甲醚对LasR的半数抑制浓度，数据来自图4B。意义：在体内定量验证了大豆苷元二甲醚与LasR的结合能力和抑制活性，其IC50为9.413 µM，表明其具有高效的群体感应抑制作用。
测定了LasR蛋白在未结合、结合天然配体、结合大豆苷元二甲醚和结合补骨脂素四种状态下的RMSD、RMSF、回转半径和氢键数量，数据来自图S4、S5、S6、S7。意义：从原子水平阐明了大豆苷元二甲醚与LasR的相互作用机制，证明其结合会破坏LasR蛋白的空间结构稳定性。
使用DCFDA和AO染色测定了大豆苷元二甲醚对PA感染斑马鱼幼虫ROS水平和细胞死亡的影响，数据来自图5。意义：证明了大豆苷元二甲醚能显著降低PA感染诱导的ROS积累和细胞凋亡，减轻氧化应激损伤和炎症反应。
测定了大豆苷元二甲醚处理对PA感染成年斑马鱼存活率的影响，数据来自图6B。意义：直接证明了大豆苷元二甲醚能显著提高PA感染斑马鱼的存活率，具有良好的体内抗感染治疗效果。
测定了斑马鱼的游泳轨迹、总游动距离和平均速度，数据来自图7。意义：证明了PA感染会导致斑马鱼出现严重的运动行为异常，而大豆苷元二甲醚处理能有效挽救这种异常，改善感染引起的生理功能障碍。
对斑马鱼肠道组织进行H&E染色，观察组织病理学变化，数据来自图8。意义：从组织学水平证明了大豆苷元二甲醚能保护PA感染引起的肠道上皮损伤、炎症细胞浸润和组织结构破坏，维持肠道屏障完整性。
8.结论
本研究首次证明了源自合欢的大豆苷元二甲醚是一种新型高效的铜绿假单胞菌群体感应抑制剂。通过虚拟筛选和体外实验，发现大豆苷元二甲醚能在不抑制细菌生长的前提下，显著抑制铜绿假单胞菌的生物膜形成以及弹性蛋白酶、绿脓素、鼠李糖脂等多种毒力因子的产生。分子机制研究表明，大豆苷元二甲醚通过与LasR蛋白特异性结合，降低其空间结构稳定性，从而显著下调lasR及其下游靶基因的转录，其对LasR的IC50为9.413 µM。体内斑马鱼感染模型实验进一步证实，大豆苷元二甲醚能显著降低PA感染诱导的ROS积累和细胞死亡，减轻全身炎症反应，将感染斑马鱼的存活率提高至80%以上，同时能挽救感染引起的异常游泳行为，并有效保护肠道组织的结构完整性。这些研究结果表明，大豆苷元二甲醚具有作为新型抗铜绿假单胞菌感染治疗药物的巨大潜力，同时也再次证明了植物化学物质是开发新型抗感染药物的重要资源宝库。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪测定了10种化合物在不同浓度下对铜绿假单胞菌生长的影响，数据来自图S3和图3A、B。该仪器通过每隔1小时自动测定600 nm处的光密度（OD600），连续监测20小时，获得了完整的细菌生长曲线，其研究意义主要体现在以下几个方面：
明确化合物的作用机制类型：通过对比不同浓度化合物处理组与对照组的生长曲线，可以准确判断化合物是通过直接抑制细菌生长（杀菌或抑菌）还是通过抑制群体感应来发挥作用。结果显示，所有10种化合物在10-160 µM浓度下的生长曲线与对照组几乎完全重合，证明其作用机制是特异性抑制群体感应系统，而非传统的杀菌或抑菌作用。这一点对于新型抗菌药物的开发至关重要，因为不抑制细菌生长的群体感应抑制剂不会对细菌产生强烈的生存选择压力，从而大大降低了诱导细菌产生耐药性的风险。
确定安全有效的实验浓度：生长曲线数据为后续的生物膜形成、毒力因子产生等实验提供了科学的浓度范围依据。本研究最终选择了10 µM和1 µM作为后续实验的浓度，这两个浓度均被证实不影响铜绿假单胞菌的正常生长，确保了后续观察到的生物膜减少和毒力因子降低是由于群体感应系统被特异性抑制，而不是由于细菌生长被抑制导致的间接结果，有效排除了实验干扰因素。
提供标准化、可重复的生长数据：Bioscreen C分析仪采用高通量、自动化的检测方式，可同时处理多达200个样品，大大减少了人工操作带来的随机误差。实验过程中温度、振荡速度、读数间隔等所有条件均由仪器精确控制且保持均一，获得的生长曲线数据具有高度的重复性和可比性，便于不同实验室之间的结果验证和对比分析。
有效排除假阳性结果：在群体感应抑制剂的筛选过程中，假阳性结果是一个非常常见的问题，即某些化合物可能通过抑制细菌生长来间接减少毒力因子的产生，而不是真正的群体感应抑制剂。Bioscreen的实时生长曲线数据可以直观地展示细菌在整个培养过程中的生长状态，从而有效排除这种假阳性结果，确保筛选出的化合物是真正通过抑制群体感应系统来发挥作用的。
为后续体内实验提供剂量参考：体外生长曲线数据表明，大豆苷元二甲醚在高达160 µM的浓度下仍不影响铜绿假单胞菌的生长，这为体内动物实验的剂量选择提供了重要的安全参考，确保在体内实验中使用的剂量既能有效抑制细菌的群体感应和毒力，又不会对宿主产生明显的毒性作用。