Bioproduction Optimization, Characterization, and Bioactivity of Extracellular Pigment Produced by Streptomyces parvulus
小链霉菌产生的细胞外色素的生物生产优化、表征及生物活性
来源：Int. J. Mol. Sci. 2025, 26, 10762
1.摘要
放线菌尤其是链霉菌是生物活性代谢物的高产者，其产生的色素在食品、纺织、化妆品和制药领域有潜在应用。鉴于合成色素的安全性和环境影响问题日益突出，本研究旨在优化小链霉菌细胞外富色素组分的生产，并评估其在药妆领域相关的生物活性。研究采用Plackett-Burman设计筛选影响代谢物生产的关键变量，再通过Box-Behnken设计进行优化。从冻干上清液中用乙酸乙酯提取得到富色素组分，通过红外光谱（IR）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行化学表征，并开展生物测定评估其抗酪氨酸酶、免疫调节和抗菌活性。结果表明，温度、培养时间和搅拌速度是最显著的影响因素，在30℃、50 rpm、培养7天的最优条件下，色素浓度达到465.3 µg/mL。LC-MS分析鉴定出三种含1,4-萘醌的化合物，分别为胡桃霉素Z（juglomycin Z）、WS-5995B和萘并吡喃霉素（naphthopyranomycin），是主要成分。富色素组分表现出中等的抗酪氨酸酶活性（300 µg/mL时抑制率为10.9%）、免疫调节作用（巨噬细胞中TNF-α抑制率最高达36.9%，IL-10刺激率最高达38.4%），以及对表皮葡萄球菌的抗菌活性（抑菌圈直径15.8 mm，生长抑制率91%）。优化后的发酵模型在提高色素产量的同时降低了资源消耗，且富色素组分具有多功能生物活性，凸显了其作为天然药妆成分的潜力。
2.关键词
放线菌、色素、抗酪氨酸酶、优化、抗炎、抗痤疮、药妆
3.研究目的
一是通过析因实验设计优化小链霉菌S145的细胞外色素生产工艺；二是利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）对富色素组分进行化学表征；三是评估富色素组分的生物活性，包括抗酪氨酸酶、抗炎和抗痤疮活性，为其在药妆领域的应用提供科学依据。
4.研究思路
首先从哥伦比亚阿劳卡河沉积物中分离得到产黄色细胞外色素的小链霉菌S145菌株，通过单因素实验筛选最优碳源和氮源；接着采用Plackett-Burman设计从温度、pH、碳氮源浓度、搅拌速度、培养时间等因素中筛选出对色素产量影响显著的关键变量；随后基于筛选结果，使用Box-Behnken响应面法对关键因素进行进一步优化，建立色素生产的二次多项式模型并在1 L生物反应器中验证其可靠性；然后对优化条件下获得的富色素组分进行UV-Vis、FTIR和LC-MS化学表征，确定其主要化学成分；最后通过一系列体外生物测定实验，评估富色素组分的抗酪氨酸酶活性、免疫调节（抗炎）活性、抗痤疮（抗菌）活性、细胞毒性及稳定性，综合分析其作为天然药妆成分的潜力。
5.研究亮点
一是首次系统优化了未被充分研究的小链霉菌S145的细胞外色素生产工艺，通过两步统计实验设计将色素产量提升至465.3 µg/mL，较初始条件提高了5.5倍，且优化条件（30℃、50 rpm、7天）成本低廉，适合实验室规模放大；二是首次鉴定出该菌株产生的富色素组分主要由三种1,4-萘醌类化合物（胡桃霉素Z、WS-5995B、萘并吡喃霉素）组成，明确了其化学本质；三是证实该富色素组分具有多功能生物活性，同时具备抗酪氨酸酶、免疫调节和抗痤疮活性，且对人皮肤成纤维细胞和角质形成细胞具有良好的生物相容性，符合药妆成分的安全性要求；四是系统评估了色素的稳定性，发现其具有优异的热稳定性（0-90℃稳定）和近中性pH稳定性，仅对光照和强碱性环境敏感，为其工业应用中的配方设计和储存条件提供了依据。
6.可延伸方向
一是开展发酵工艺的中试和工业化放大研究，优化大规模发酵的参数（如通气量、溶氧、补料策略等），进一步降低生产成本；二是分离纯化富色素组分中的三种单一活性化合物，分别测定其生物活性，明确各化合物的贡献及可能的协同作用；三是进行体内动物实验，验证该色素在皮肤美白、抗炎和抗痤疮方面的实际功效及长期安全性；四是针对色素对光照敏感的问题，开发微胶囊包埋、脂质体包裹等稳定化技术，提高其在产品中的稳定性；五是利用代谢工程和合成生物学技术对小链霉菌S145进行基因改造，激活沉默的生物合成基因簇，进一步提高色素产量或获得结构新颖的活性衍生物；六是探索该色素在食品着色、纺织印染等其他领域的应用潜力。
7.测量的数据及研究意义
测定了葡萄糖、淀粉、乳糖、甘油、蔗糖五种碳源对菌株生长和色素生产的影响，数据来自图1。意义：确定可溶性淀粉为最优碳源，其缓慢水解特性可减少分解代谢物阻遏，延长碳源供应时间，促进次级代谢和色素生物合成，为后续培养基优化奠定基础。
测定了硫酸铵、硝酸钾、氯化铵、酵母提取物-麦芽提取物、酪蛋白五种氮源对菌株生长和色素生产的影响，数据来自图2。意义：确定酵母提取物-麦芽提取物为最优氮源，其不仅能支持菌株快速生长和高产色素，且成本低于酪蛋白，适合工业化生产。
测定了温度、pH、培养时间、碳氮源浓度、搅拌速度六个因素对色素产量的影响，数据来自表1、图3和表3。意义：筛选出温度、pH、搅拌速度、培养时间为影响色素产量的显著因素，建立了色素生产的一阶多项式模型，为后续响应面优化指明了方向。
测定了温度、搅拌速度、培养时间三个关键因素交互作用下的色素产量，数据来自表2、图4和表4。意义：建立了色素生产的二阶多项式模型，确定了最优生产条件（30℃、50 rpm、7天），使色素产量提升5.5倍，且模型验证误差仅1.72%，具有良好的预测性和可靠性。
包括UV-Vis吸收光谱、FTIR光谱和LC-MS质谱数据，数据来自图S1、图S2、图S3和图S4。意义：明确了富色素组分的化学结构特征，鉴定出三种主要的1,4-萘醌类化合物，为解释其生物活性提供了化学基础。
测定了不同浓度富色素组分对蘑菇酪氨酸酶的抑制率，并与曲酸对比，数据来自图5。意义：证实该色素具有中等的酪氨酸酶抑制活性，提示其可作为天然皮肤美白或抗褐变剂，为药妆应用提供了依据。
测定了富色素组分对LPS刺激的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-10的影响，并与布洛芬对比，数据来自图6。意义：证实该色素具有双重免疫调节作用，既能下调促炎细胞因子TNF-α，又能上调抗炎细胞因子IL-10，其抗炎效果与布洛芬相当，且具有布洛芬不具备的IL-10上调作用。
包括纸片扩散法的抑菌圈直径和Bioscreen C分析仪测定的表皮葡萄球菌生长动力学数据，数据来自图7。意义：证实该色素对痤疮相关致病菌表皮葡萄球菌具有显著的抑菌活性，300 µg/mL时可抑制91%的细菌生长，且具有抑菌作用，为其作为天然抗痤疮成分提供了直接证据。
测定了富色素组分对人皮肤成纤维细胞（HDFa）和角质形成细胞（HaCaT）的存活率影响，数据来自图8。意义：证实该色素在300 µg/mL浓度下对两种皮肤细胞的存活率均高于80%，符合ISO 10993-12的生物相容性标准，确保了其在皮肤外用产品中的安全性。
测定了富色素组分在光照、不同温度和不同pH条件下的残留率，数据来自图9。意义：明确了色素的稳定性特征，其具有优异的热稳定性和近中性pH稳定性，仅对光照和强碱性环境敏感，为其工业生产、配方设计和储存条件提供了重要指导。
8.结论
本研究证实，从哥伦比亚阿劳卡河沉积物中分离的小链霉菌S145是一种具有潜力的生物活性色素生产菌株。通过Box-Behnken统计优化确定了最优发酵条件为30℃、50 rpm搅拌、培养7天，该条件下色素产量达465.3 µg/mL，模型验证误差仅1.72%，优化策略可靠。化学表征表明，富色素组分主要由胡桃霉素Z、WS-5995B和萘并吡喃霉素三种1,4-萘醌类化合物组成。该组分具有多功能生物活性，包括中等的抗酪氨酸酶活性、双重免疫调节抗炎活性和显著的抗表皮葡萄球菌活性，且对人皮肤成纤维细胞和角质形成细胞具有良好的生物相容性。稳定性研究显示，色素在0-90℃和pH 5-7条件下稳定，仅在光照和强碱性（pH≥11）环境下发生降解。综上，小链霉菌S145来源的色素是一种天然、多功能的药妆成分候选物，有望替代合成色素应用于化妆品和个人护理产品中。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定了不同浓度富色素组分处理下表皮葡萄球菌的生长动力学，数据来自图7B。该仪器通过每隔30分钟自动测定600 nm处的光密度（OD600），连续监测20小时，获得了完整的细菌生长曲线，其研究意义主要体现在以下方面：
精准量化抗菌活性的强度和时效：纸片扩散法仅能反映24小时后的抑菌圈大小，而Bioscreen的实时生长曲线可以动态展示细菌在不同时间点的生长状态。结果显示，300 µg/mL的富色素组分可抑制91%的表皮葡萄球菌生长，其生长速率常数μ仅为0.00917±0.000749 h⁻¹，远低于对照组，明确了该浓度下的抑菌效率；同时发现30 µg/mL和3 µg/mL浓度下无显著抑菌作用，确定了有效抑菌浓度阈值。
揭示抗菌作用的模式：生长曲线显示，300 µg/mL的富色素组分处理后，细菌增殖被延迟了12小时，之后生长才逐渐恢复，表明该色素对表皮葡萄球菌主要表现为抑菌作用而非杀菌作用，这与万古霉素的杀菌作用模式不同。这一发现对于临床应用中的给药方案设计具有重要指导意义，提示该色素作为抗痤疮成分时，需要维持足够的局部浓度和作用时间。
提供标准化、可重复的抗菌数据：Bioscreen C分析仪采用高通量、自动化的检测方式，可同时处理多个样品，减少了人工操作带来的误差，且实验条件（温度、通气、读数间隔）均一可控，获得的生长动力学数据具有高度的重复性和可比性，便于不同研究之间的结果对比。
为后续配方优化提供依据：通过不同浓度下的生长曲线，可以建立色素浓度与抑菌效果之间的量效关系，为确定药妆产品中该色素的最低有效添加量提供了数据支持，有助于在保证功效的前提下降低产品成本。
补充纸片扩散法的局限性：纸片扩散法无法区分抑菌和杀菌作用，也不能反映抗菌活性的动态变化，而Bioscreen的生长曲线数据弥补了这一不足，全面评估了该色素的抗菌特性，为其作为天然抗痤疮成分的开发提供了更全面、更深入的科学依据。