Characterization and application of indigenous microbial strains in mixed-culture fermentation of cashew apple juice
腰果苹果汁混合发酵中本土微生物菌株的特性鉴定与应用
来源：Applied Food Research 6 (2026) 101839
1.论文摘要核心内容
本研究评估了从发酵腰果苹果制品中分离的本土酵母菌、乳酸菌（LAB）和醋酸菌（AAB）的工艺与功能潜力，旨在开发混合菌种发酵的低酒精饮料。通过16S rRNA和ITS区DNA测序，共鉴定出52株分离株（34株酵母、14株LAB、4株AAB）；利用微孔板培养与高效液相色谱（HPLC），监测菌株在澄清腰果苹果汁中的生长与代谢产物生成动力学，筛选出性能优异的微生物菌株。研究发现，优势酵母菌种为仙人掌汉逊酵母（Hanseniaspora opuntiae）、库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），优势细菌为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）和巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus）。筛选出的菌株具备独特且互补的技术功能特性：酿酒酵母Sac11乙醇产率达40 g/L且生长迅速；毕赤酵母Pik4a与汉逊酵母Hao71可产乙酸异戊酯、癸酸乙酯等花果香酯类物质；植物乳杆菌Lap21与巴氏醋酸杆菌AAB36可实现体系酸化与氧化稳定性调控。通过2²全因子设计筛选不同菌群组合与发酵条件，经合意性分析，确定了目标饮料需满足pH 3.5~3.8、糖度8~10°Brix、乙醇含量低于20 g/L，且具备愉悦果香、轻微起泡感的感官特征。CATA法与喜好度测试结果显示，Lap21+AAB36+Sac11菌群组合发酵的饮料接受度最高。研究结果凸显了西非本土微生物菌株在热带水果可持续生物转化中的工艺应用价值。
2.论文关键词
发酵、饮料、本土菌株、挥发性化合物、感官分析、腰果苹果
3.研究目的
系统鉴定腰果苹果自发发酵体系中的本土酵母、乳酸菌、醋酸菌资源，明确发酵过程中微生物群落的演替规律与物种多样性；
全面评估分离菌株的生长动力学、糖代谢能力、有机酸/乙醇/挥发性风味物质生成能力等技术功能特性，筛选出性能互补的优势菌株；
构建酵母-乳酸菌-醋酸菌混合发酵菌群组合，优化发酵时间与接种量等关键工艺参数，开发符合低酒精、适度酸甜、风味愉悦特征的新型腰果苹果发酵饮料；
解析不同菌群组合发酵饮料的生化特征、挥发性风味谱与感官特性，明确菌株间的代谢互作与功能协同效应；
为腰果苹果这一未充分利用的农业副产物的高值化利用提供技术支撑，同时丰富热带水果发酵的本土微生物菌种资源库。
4.研究思路
第一步，样品采集与菌株分离纯化：从贝宁当地腰果苹果产业链的自发发酵醪液、果酒、果醋，以及实验室不同阶段的腰果苹果 pulp/果汁发酵样品中，分离纯化酵母、乳酸菌、醋酸菌菌株，建立本土菌株库；
第二步，菌株分子生物学鉴定：提取菌株基因组DNA，通过PCR扩增细菌16S rRNA区与酵母ITS区，经Sanger测序与NCBI数据库比对，完成所有分离株的物种水平鉴定；
第三步，第一轮菌株筛选：通过Bioscreen C MBR系统监测菌株在腰果苹果汁中的48 h生长动力学，计算最大比生长速率、延滞期、最大生物量；利用HPLC定量分析菌株发酵48 h后的糖消耗、有机酸与乙醇生成量，基于生长性能与代谢能力完成初筛，获得8株酵母、3株乳酸菌、1株醋酸菌；
第四步，第二轮菌株筛选：通过API 50 CHL试剂盒分析乳酸菌的次级碳水化合物发酵能力，筛选出代谢谱最广的Lap21菌株；通过动态顶空-气相色谱-质谱联用（DHS-GC-MS）分析酵母发酵液的挥发性风味物质谱，基于风味生成潜力筛选出Sac11、Pik4a、Hao71菌株；
第五步，混合发酵菌群构建与可行性验证：设计4组酵母-LAB-AAB菌群组合，验证菌株在共接种体系中的生长活力，排除无法在混合体系中生长的Hao71菌株，确定3组核心菌群（C2、C3、C4）；
第六步，发酵工艺参数优化：采用2²全因子设计，以发酵时间、初始接种量为变量，通过一阶模型拟合与多响应合意性分析，基于目标饮料的理化指标阈值，筛选出3组菌群的最优发酵工艺区间；
第七步，发酵饮料的系统表征：在最优工艺条件下制备3组发酵饮料，分析其最终微生物组成、生化特征、多酚与黄酮含量、挥发性风味谱；
第八步，饮料感官评价：通过73名参与者的CATA法与9点喜好度测试，分析不同饮料的感官特征与消费者接受度，确定最优菌群组合；
第九步，结果整合与结论分析：综合菌株特性、菌群互作、发酵工艺、风味与感官结果，明确本土菌株在腰果苹果混合发酵中的应用价值，提出后续研究方向。
5.研究亮点
首次系统解析了西非腰果苹果发酵体系的微生物多样性，完成了52株本土酵母、乳酸菌、醋酸菌的全部分子鉴定与技术功能特性评估，填补了腰果苹果发酵乳酸菌资源研究的空白，丰富了热带水果发酵的本土微生物种质资源库；
明确了腰果苹果自发发酵过程中微生物的生态演替规律：非酿酒酵母与乳酸菌主导发酵初期，酿酒酵母与植物乳杆菌驱动主发酵阶段，巴氏醋酸杆菌主导后期氧化阶段，为腰果苹果可控发酵的菌种设计提供了生态学理论依据；
筛选出功能高度互补的本土菌株组合，实现了发酵体系的精准调控：酿酒酵母Sac11保障乙醇生成与发酵效率，毕赤酵母Pik4a与汉逊酵母Hao71贡献花果香风味，植物乳杆菌Lap21实现快速酸化与体系稳定，巴氏醋酸杆菌AAB36调控氧化稳定性与风味复杂度，突破了单一菌种发酵的风味与功能局限；
建立了基于多响应合意性分析的混合发酵工艺优化体系，通过2²全因子设计明确了不同菌群的最优发酵参数，实现了低酒精、适度酸甜、风味平衡的发酵饮料的可控制备，为热带水果混合发酵饮料的工艺开发提供了标准化方法；
结合生化分析、风味组学与消费者感官评价，系统解析了不同菌群组合对饮料品质的影响，发现Lap21+AAB36+Sac11组合发酵的饮料具备最佳的感官接受度，同时揭示了菌株代谢互作对风味与感官特征的调控机制；
实现了腰果苹果这一仅10%被利用的农业副产物的高值化转化，开发出新型低酒精发酵饮料，为热带农业副产物的可持续利用提供了创新的生物技术路径，兼具经济价值与环境效益；
证实了西非本土微生物菌株在热带水果发酵中的独特应用价值，相较于商业发酵剂，本土菌株更适配腰果苹果基质，可更好地保留产品的地域特征与风味典型性。
6.可延伸的方向
采用响应面法结合二次项模型，补充更多设计点，深入探究发酵温度、pH、溶氧量等非线性因素对发酵过程的影响，进一步优化发酵工艺参数，实现产品品质的精准调控；
利用代谢组学、转录组学与共培养模型，解析混合发酵体系中酵母、乳酸菌、醋酸菌之间的代谢交叉喂养、竞争互作与功能协同的分子机制，阐明菌株互作调控风味生成与发酵性能的核心通路；
开展发酵饮料的中试放大生产、货架期稳定性评估，探究储存过程中微生物活力、风味物质、理化指标的动态变化，优化产品的保鲜与储存工艺，为工业化生产提供技术支撑；
系统评估筛选出的植物乳杆菌Lap21、酵母菌株的体外/体内益生特性，以及发酵饮料的益生菌、后生元相关健康功效，拓展产品的功能属性与市场价值；
研发基于本土菌株的复合发酵剂，优化菌株的冻干保护剂配方与菌剂制备工艺，开发适配腰果苹果及其他热带水果发酵的标准化商业发酵剂；
探究不同菌群组合对腰果苹果汁中多酚、黄酮等活性物质的生物转化作用，以及发酵对果汁涩味、抗氧化活性的调控机制，进一步提升产品的营养与功能特性；
开展消费者细分群体的偏好性研究，基于不同地域、年龄、消费习惯的人群需求，优化产品的风味、口感与酒精度，开发无酒精、高起泡性、功能性等多元化的腰果苹果发酵饮料产品。
7.测量的数据、对应图表及研究意义
微生物分离与物种鉴定数据
测量内容：1120份样品中分离得到153株弯曲杆菌，其中120株C. coli（78.4%）、33株C. jejuni（21.5%）；52株微生物分离株的物种鉴定结果，包括34株酵母（3属8种）、14株LAB（3属3种）、4株AAB（1属1种），以及不同菌株的分离时间与来源
数据来源：表2
研究意义：明确了腰果苹果发酵体系的微生物物种组成与群落演替规律，建立了本土微生物菌株库，为后续菌株筛选与混合发酵菌群构建提供了核心种质资源。
菌株生长动力学与初级代谢特性数据
测量内容：所有分离株的延滞期（λ）、最大比生长速率（µmax）、最大生物量（Nmax）；发酵48 h后葡萄糖、果糖消耗量，乳酸、乙酸、乙醇生成量
数据来源：表3、图2
研究意义：完成了菌株的第一轮功能筛选，明确了不同菌株的生长性能与基础代谢能力，筛选出具备高生长速率、强发酵能力的优势菌株，为混合发酵的菌株选择提供了量化依据。
菌株次级代谢与功能特性数据
测量内容：3株植物乳杆菌的API 50 CH碳水化合物发酵谱；8株酵母发酵液中19种挥发性风味物质的相对含量，涵盖酯类、醇类、有机酸、酮类、醛类五大类，以及对应物质的风味特征
数据来源：表4、表5
研究意义：完成了菌株的第二轮精细化筛选，明确了乳酸菌的代谢灵活性与酵母的风味生成潜力，筛选出代谢谱最广的Lap21与风味贡献最优的Sac11、Pik4a、Hao71，为混合发酵的功能互补菌株组合设计提供了核心依据。
混合发酵工艺优化数据
测量内容：2²全因子设计的5组试验结果；发酵时间、接种量对3组菌群发酵体系微生物生长、理化指标的影响模型系数；通过合意性分析确定的3组菌群最优发酵时间与接种量区间
数据来源：表6、补充表S1-S2、补充图S1-S3
研究意义：明确了发酵时间与接种量对发酵过程的调控作用，建立了发酵参数与产品品质的关联模型，确定了目标饮料品质对应的最优工艺区间，实现了混合发酵过程的可控化与标准化。
发酵饮料的微生物与生化特征数据
测量内容：3组最优工艺发酵饮料的最终微生物组成与各菌株活菌数；pH、糖度、有机酸、乙醇、还原糖、单宁、黄酮等理化指标；主成分分析（PCA）揭示的3组饮料生化与风味特征差异
数据来源：表7、图3
研究意义：验证了优化工艺的稳定性，明确了不同菌群组合发酵饮料的生化与风味特征差异，揭示了BC2（花果香酯类主导）、BC3（乙醇与乙酸主导，单宁含量低）、BC4（醇类与羰基化合物主导）三种差异化的产品特征，为产品的感官评价与应用定位提供了数据支撑。
发酵饮料的感官评价数据
测量内容：73名参与者CATA测试得到的24个区分性感官属性；对应分析（CA）揭示的3组饮料感官特征差异；9点喜好度测试得到的消费者接受度结果
数据来源：图4
研究意义：明确了不同发酵饮料的感官特征与消费者偏好，证实了Lap21+AAB36+Sac11组合发酵的BC3饮料接受度最高，为最终产品的配方定型与市场推广提供了消费者层面的核心依据。
8.研究核心结论
腰果苹果自发发酵体系中蕴含丰富的本土微生物资源，核心优势菌种为仙人掌汉逊酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、酿酒酵母、植物乳杆菌与巴氏醋酸杆菌，发酵过程呈现清晰的微生物生态演替规律，为可控混合发酵的菌种设计提供了生态学基础。
筛选出的本土菌株具备高度互补的技术功能特性：酿酒酵母Sac11发酵效率高、乙醇产率优异；毕赤酵母Pik4a与汉逊酵母Hao71是核心风味生成菌株，可产生丰富的花果香酯类物质；植物乳杆菌Lap21具备最广的碳水化合物代谢谱与强酸化能力；巴氏醋酸杆菌AAB36可高效调控体系的氧化稳定性，是混合发酵体系的核心功能菌株。
酵母-乳酸菌-醋酸菌混合发酵体系中，菌株间存在复杂的代谢互作与竞争关系，汉逊酵母Hao71无法在混合体系中实现有效生长，而植物乳杆菌在所有发酵体系中均呈现轻微的生长优势，混合发酵的性能并非单一菌株功能的简单叠加，而是菌株间互作的综合结果。
基于多响应合意性分析，确定了3组核心菌群的最优发酵工艺：C2（Pik4a+Lap21+AAB36）为6 log CFU/mL接种量发酵72 h；C3（Sac11+Lap21+AAB36）为4 log CFU/mL接种量发酵60 h；C4（Pik4a+Sac11+Lap21+AAB36）为3 log CFU/mL接种量发酵72 h，可实现目标饮料的理化品质精准调控。
不同菌群组合可产生差异化的产品特征：C2发酵的BC2饮料以花果香酯类为主，香气浓郁但涩味与酸味过重，接受度最低；C3发酵的BC3饮料呈干型葡萄酒特征，单宁含量低，口感平衡，消费者接受度最高；C4发酵的BC4饮料具备强起泡性，口感介于前两者之间，可开发为开菲尔/康普茶类发酵饮料。
酿酒酵母Sac11、植物乳杆菌Lap21与巴氏醋酸杆菌AAB36组成的菌群组合，可实现发酵体系的快速酸化、适度风味富集与微生物稳定性，在10⁴ CFU/mL接种量、60 h发酵条件下，可制备出酸度适中、低酒精、愉悦果香、高感官接受度的腰果苹果发酵饮料，是腰果苹果高值化利用的最优本土菌株组合。
西非本土微生物菌株在热带水果发酵中具备独特的应用价值与巨大的开发潜力，可为地域特色发酵食品的创新开发提供核心菌种支撑，同时实现农业副产物的可持续高值化转化。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C MBR全自动微生物生长曲线分析仪，完成了所有52株分离株在腰果苹果汁基质中的48 h生长动力学全程实时监测，该仪器获得的生长曲线数据是本研究菌株第一轮筛选的核心基础，其研究意义主要体现在以下方面：
实现菌株生长性能的高通量、精准量化表征
本研究需同时完成数十株菌株的平行生长试验，Bioscreen C的100孔微孔板体系，可同时完成所有菌株的5次生物学重复平行培养，精准控制30℃恒温培养条件，每10 min自动测定一次OD600数值，完整绘制了48 h内每一株菌的生长曲线。基于生长曲线数据，精准计算出每株菌的最大比生长速率（µmax）、延滞期（λ）、最大生物量（Nmax）三个核心生长动力学参数，实现了不同菌株生长性能的标准化、量化对比，为初筛提供了核心的量化指标，避免了传统手动培养方法的误差与低效性。
筛选出适配腰果苹果汁基质的高活力菌株
腰果苹果汁是高糖、低pH的复杂水果基质，与人工合成培养基相比，更贴合实际发酵场景。Bioscreen C仪器在腰果苹果汁基质中完成的生长动力学监测，直接反映了菌株在实际发酵基质中的生长活力与环境适应性。通过生长参数的对比，快速淘汰了延滞期过长（如Pim13、Pisp95、Lif22、Pea65）、生长速率慢、生物量低的低竞争力菌株，筛选出在腰果苹果汁中生长迅速、活力强的优势菌株，保障了后续混合发酵中菌株的定植与生长能力，为发酵的稳定性与效率提供了基础保障。
建立菌株生长特性与代谢能力的关联分析基础
结合Bioscreen C获得的生长动力学数据，与HPLC检测的48 h发酵代谢产物数据，研究建立了菌株生长特性与糖代谢、有机酸/乙醇生成能力的关联。例如，发现酿酒酵母Sac11虽延滞期略长，但最大比生长速率高，乙醇产率最优；植物乳杆菌Lap21生长速率快，乳酸生成能力强，明确了“生长性能-代谢能力”的对应关系，为菌株的功能分类与混合发酵的互补组合设计提供了关键依据。
为后续发酵工艺参数优化提供了基础动力学数据
Bioscreen C获得的菌株延滞期、指数生长期、稳定期的时间节点数据，为后续混合发酵的接种量、发酵时间优化提供了核心的动力学参考。例如，基于菌株的生长速率，确定了10³~10⁶ CFU/mL的接种量范围与24~72 h的发酵时间区间，为全因子试验的参数设置提供了科学依据，避免了工艺优化的盲目性。
建立了标准化的本土菌株生长性能评价体系
本研究基于Bioscreen C仪器建立的腰果苹果汁基质中微生物生长动力学检测方法，具备高重复性、高通量、标准化的特点，不仅完成了本次研究的菌株筛选，还为后续腰果苹果及其他热带水果发酵菌株的性能评价、菌种改良、发酵剂开发提供了统一、可靠的实验平台与评价方法。