Characterization and application of a novel Campylobacter phage CC_R7 as a biocontrol agent in chicken meat
新型弯曲杆菌噬菌体CC_R7的特性鉴定及其在鸡肉中作为生物防控剂的应用
来源：Current Research in Food Science 11 (2025) 101182
1.论文摘要核心内容
弯曲杆菌是全球主要的食源性致病菌，家禽是其最主要的传播载体，家禽养殖中抗生素的滥用导致多重耐药菌株广泛流行，亟需开发噬菌体生物防控等抗生素替代策略。本研究首先分析了家禽源空肠弯曲杆菌（C. jejuni）与结肠弯曲杆菌（C. coli）的耐药谱，同时分离、鉴定了一株新型裂解性弯曲杆菌噬菌体CC_R7，完成了其全基因组解析与系统发育分析，系统表征了其生物学特性，并评估了其在屠宰场模拟条件下的生物膜清除能力，以及在鸡肉中的生物防控效果。结果显示，C. coli的耐药率显著高于C. jejuni；噬菌体CC_R7基因组全长180566 bp，未检出毒力、耐药与溶原性相关基因，宿主范围广，可裂解60%受试C. coli菌株与27.2%的C. jejuni菌株，吸附能力优异，潜伏期仅40 min，裂解量达119 PFU/感染细胞，在4℃~50℃、pH 4~10范围内保持良好稳定性；该噬菌体可有效抑制弯曲杆菌生物膜形成，24 h内可使冷藏鸡肉中的弯曲杆菌污染量降低1.2 log/g。综上，噬菌体CC_R7可高效对抗多重耐药弯曲杆菌，具备作为食品生物防控剂与饲料添加剂的巨大潜力。
2.论文关键词
弯曲杆菌、噬菌体CC_R7、生物学特性、环境稳定性、生物膜清除、鸡肉、生物防控、食源性致病菌
3.研究目的
系统解析中国华中地区家禽源C. coli与C. jejuni的流行特征、抗生素耐药谱与多重耐药流行现状，明确该地区弯曲杆菌的公共卫生风险；
分离、纯化并筛选出对多重耐药弯曲杆菌具有高效裂解活性的新型裂解性噬菌体，完成菌株的纯培养与初步鉴定；
完成噬菌体CC_R7的全基因组测序、功能注释与系统发育分析，评估其基因组安全性，明确其分类学地位；
全面表征噬菌体CC_R7的核心生物学特性，包括吸附效率、感染动力学、宿主范围、温度与pH耐受性、液体环境裂解活性；
评估噬菌体CC_R7在模拟屠宰场条件下对弯曲杆菌生物膜的清除能力，以及冷藏鸡肉中对弯曲杆菌污染的实际防控效果；
为家禽养殖、屠宰、加工全链条中多重耐药弯曲杆菌的防控，提供安全、高效的新型噬菌体生物防控剂候选株，为食源性弯曲杆菌的防控提供理论与实验支撑。
4.研究思路
第一步，弯曲杆菌分离与耐药性分析：从湖北、湖南、江西三省家禽养殖场粪便样本中分离弯曲杆菌，通过多重PCR完成菌种鉴定，采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法，测定9种临床常用抗生素对153株分离株的耐药表型，分析耐药谱与多重耐药率；
第二步，噬菌体的分离与纯化：以分离的耐药C. coli为宿主菌，从湖北家禽养殖场粪便样本中富集噬菌体，通过双层平板法完成噬菌体的初筛与3轮连续单斑纯化，获得纯培养物，再通过全裂解平板法完成噬菌体规模化增殖，氯化铯密度梯度离心实现高纯度纯化；
第三步，噬菌体形态学鉴定：通过透射电子显微镜观察纯化后噬菌体的头部、尾部形态特征，完成初步的科属分类；
第四步，全基因组测序与生物信息学分析：提取噬菌体基因组DNA，通过DNBSEQ-T7平台完成全基因组测序，经质控、从头组装、缺口填补与环化获得完整基因组序列；完成ORF预测、功能注释、tRNA识别，通过系统发育分析与全基因组比对明确其分类学地位，同时筛查毒力、耐药、溶原性相关基因，评估基因组安全性；
第五步，噬菌体生物学特性系统表征：通过吸附试验测定噬菌体对宿主菌的吸附效率；一步生长曲线试验明确其潜伏期与裂解量；斑点法测定其对不同来源弯曲杆菌的宿主裂解谱；设置不同温度、pH梯度，评估噬菌体的环境稳定性；
第六步，噬菌体裂解活性与生物膜清除能力评估：利用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪，测定不同感染复数（MOI）下噬菌体在液体培养基中对宿主菌的裂解动力学与生长抑制效果；模拟屠宰场的温度与营养条件，通过结晶紫染色法，评估噬菌体在42℃与10℃下对弯曲杆菌生物膜的清除能力；
第七步，鸡肉中实际应用效果验证：构建人工污染弯曲杆菌的鸡胸肉模型，评估4℃冷藏条件下，噬菌体对鸡肉中弯曲杆菌的杀灭效果，测定0、3、6、12、24 h的活菌数变化；
第八步，结果整合与结论分析：综合耐药性流行病学数据、噬菌体生物学特性、基因组分析与应用效果数据，明确噬菌体CC_R7的应用潜力，提出后续研究方向。
5.研究亮点
首次分离并系统鉴定了一株新型裂解性弯曲杆菌噬菌体CC_R7，明确其属于肌尾病毒科Firehammervirus属，为II群弯曲杆菌噬菌体，与已知同源性最高的噬菌体CP220全基因组核苷酸同源性仅93.84%，是该属的新物种，极大丰富了弯曲杆菌噬菌体的种质资源库；
明确了中国华中地区家禽源弯曲杆菌的流行与耐药特征，发现C. coli为优势流行菌种（占比78.4%），且其耐药率与多重耐药率（95%）显著高于C. jejuni（85%），为该地区家禽源弯曲杆菌的耐药性防控提供了核心流行病学数据；
噬菌体CC_R7具备优异的生物学特性，宿主范围广，可高效裂解不同地区来源的多重耐药C. coli与C. jejuni；吸附速度快，5 min内即可完成50%宿主菌的吸附；潜伏期短（40 min）、裂解量高（119 PFU/感染细胞），显著优于多数已报道的弯曲杆菌噬菌体，具备极强的裂解增殖能力；
噬菌体CC_R7环境适应性强，在4℃~50℃、pH 4~10范围内滴度无显著变化，可适配家禽养殖、屠宰、加工、冷链储存全链条的复杂环境条件，具备工业化应用的核心环境适应性基础；
全基因组分析证实CC_R7不含溶原性整合酶、毒力因子、抗生素耐药与致病相关基因，从基因组层面证实了其作为食品生物防控剂的遗传安全性，完全符合噬菌体食品应用的安全标准；
首次证实该噬菌体在模拟屠宰场的低温（10℃）与宿主最适生长温度（42℃）下，均可有效清除弯曲杆菌生物膜，解决了家禽屠宰环节生物膜污染难以防控的行业痛点；同时在4℃冷藏鸡肉中可使弯曲杆菌载量显著降低1.2 log CFU/g，直接验证了其在食品加工与冷链环节的实际应用价值；
针对家禽产业链多重耐药弯曲杆菌防控的核心痛点，提供了一种安全、高效、特异性强的抗生素替代方案，为食源性弯曲杆菌污染的全链条防控提供了全新的技术路径。
6.可延伸的方向
解析噬菌体CC_R7宿主识别的分子机制，明确其受体结合蛋白与宿主菌表面受体的相互作用模式，为拓宽噬菌体宿主范围、优化裂解活性提供分子基础；
研发基于CC_R7的噬菌体鸡尾酒配方，联合不同宿主谱、不同作用机制的弯曲杆菌噬菌体，进一步提升裂解效率、拓宽宿主范围，降低噬菌体抗性的发生风险；
开展肉鸡体内动物实验，评估CC_R7对家禽肠道弯曲杆菌定植的清除效果、生物安全性，以及对家禽肠道正常菌群的影响，为其作为饲料添加剂的商业化应用提供体内数据支撑；
优化噬菌体CC_R7的规模化发酵生产工艺、冻干保护剂配方与长期储存条件，建立工业化生产与制剂标准，推动其商业化落地；
探究弯曲杆菌对CC_R7产生抗性的分子机制与发生频率，制定噬菌体轮换使用、与天然抑菌物质联用等针对性抗性防控策略，保障其长期应用效果；
评估CC_R7与有机酸、植物精油、辐照、热处理等食品加工常用抑菌手段的协同作用，建立复合抑菌体系，进一步提升鸡肉中弯曲杆菌的防控效果；
开展CC_R7在家禽养殖、屠宰、加工、冷链、零售全链条的现场中试试验，验证其在实际生产场景中的防控效果与稳定性，建立全链条的噬菌体应用规范。
7.测量的数据、对应图表及研究意义
家禽源弯曲杆菌流行与耐药性数据
测量内容：1120份家禽粪便样本中弯曲杆菌总分离率13.3%，其中C. coli 120株（78.4%）、C. jejuni 33株（21.5%）；9种抗生素对两类菌株的耐药率；C. coli多重耐药率95%，C. jejuni多重耐药率85%
数据来源：表1、表2
研究意义：明确了华中地区家禽源弯曲杆菌的优势菌种与严峻的多重耐药现状，凸显了研发抗生素替代防控手段的紧迫性，为噬菌体的应用场景提供了流行病学依据。
噬菌体CC_R7形态学鉴定数据
测量内容：噬菌体在双层平板上形成直径1~2 mm的透明噬菌斑；透射电镜下呈二十面体头部（直径97.4±5.66 nm）、可收缩长尾（长度126.8±3.2 nm），符合肌尾病毒科特征
数据来源：图1
研究意义：完成了噬菌体的形态学分类，证实其符合II群弯曲杆菌噬菌体的形态特征，为其分类学鉴定与裂解性表型提供了直观的形态学证据。
噬菌体CC_R7全基因组与生物信息学分析数据
测量内容：基因组全长180566 bp，GC含量27.8%；预测200个ORF，其中87个获得功能注释，分为形态发生、裂解、DNA复制/修饰/修复、附加功能、假定蛋白五大模块；含2个tRNA基因；未检出溶原性、毒力、耐药相关基因；与噬菌体CP220全基因组核苷酸同源性93.84%，种间相似性79.3%
数据来源：图2、图3、图4、图5、补充表S5-S6
研究意义：完成了噬菌体全基因组完整图谱绘制与功能注释，明确了其Firehammervirus属新物种的分类学地位；从基因组层面证实了其应用安全性，为理解其感染、复制、裂解机制提供了分子基础。
噬菌体CC_R7感染动力学与生物学特性数据
测量内容：5 min内完成50%宿主菌吸附；潜伏期40±5 min，裂解量119±10 PFU/感染细胞；可裂解60%（21/34）受试C. coli、27.3%（6/22）受试C. jejuni；4~50℃滴度无显著变化，pH 4~10范围内稳定
数据来源：图6、图7、补充表S4
研究意义：系统表征了噬菌体的核心生物学特性，证实其具备高效裂解能力、广谱宿主范围与优异的环境稳定性，为其应用场景选择、使用条件优化提供了关键的生物学参数。
噬菌体CC_R7液体环境裂解活性数据
测量内容：不同MOI（0.1、0.001、0.0001）下噬菌体对宿主菌的生长抑制效果，MOI 0.1时抑制效果最强，12 h时对照组OD600达0.5，处理组仅0.22，21 h后宿主菌出现轻微再生长
数据来源：图8
研究意义：证实了噬菌体在液体环境中对宿主菌的高效裂解活性，明确了最佳作用MOI，为其在家禽饮用水、屠宰清洗液等液体场景中的应用提供了浓度参考。
噬菌体CC_R7生物膜清除与鸡肉应用效果数据
测量内容：42℃和10℃模拟屠宰场条件下，MOI 100的噬菌体对弯曲杆菌生物膜清除效果最显著；4℃冷藏条件下，噬菌体处理24 h使鸡肉中弯曲杆菌载量降低1.2 log CFU/g
数据来源：图9
研究意义：证实了噬菌体对弯曲杆菌生物膜的有效清除能力，解决了屠宰环节生物膜污染的防控难点；同时验证了其在冷藏鸡肉中的实际杀菌效果，为其作为鸡肉生物防控剂提供了直接的实验证据。
8.研究核心结论
中国华中地区家禽源弯曲杆菌中，C. coli为优势流行菌种，其抗生素耐药率与多重耐药率显著高于C. jejuni，家禽源多重耐药弯曲杆菌已呈现严峻的流行态势，亟需安全有效的抗生素替代防控手段。
本研究分离的新型噬菌体CC_R7属于肌尾病毒科Firehammervirus属，为II群弯曲杆菌噬菌体，是该属的新物种；其基因组不含任何溶原性、毒力、耐药相关基因，具备作为食品生物防控剂的遗传安全性。
噬菌体CC_R7具备优异的生物学特性，宿主范围广，可高效裂解多重耐药C. coli与C. jejuni；吸附速度快、潜伏期短、裂解量高，对宿主菌具有极强的裂解活性；在4℃~50℃、pH 4~10范围内保持良好稳定性，可适配家禽产业链全环节的复杂环境。
噬菌体CC_R7在模拟屠宰场的常温与低温条件下，均可有效清除弯曲杆菌生物膜；在4℃冷藏鸡肉中，24 h内可使弯曲杆菌载量显著降低1.2 log CFU/g，具备良好的实际应用效果。
噬菌体CC_R7是一株安全、高效、环境适应性强的裂解性弯曲杆菌噬菌体，可作为生物防控剂有效防控家禽产业链中多重耐药弯曲杆菌的污染，为食源性弯曲杆菌的防控提供了新型的抗生素替代方案。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪（Oy Growth Curves Ab Ltd），完成了噬菌体CC_R7在液体培养基中对宿主C. coli的裂解活性与生长抑制动力学的全程实时监测，该仪器获得的生长曲线数据是本研究的核心实验数据之一，其研究意义主要体现在以下方面：
精准量化噬菌体裂解动力学，明确最佳作用感染复数
本研究通过Bioscreen C仪器，实现了3个不同MOI（0.1、0.001、0.0001）处理组、阳性对照组、空白对照组的高通量、自动化、实时连续监测，每30 min自动记录一次OD600数值，完整绘制了24 h内宿主菌的生长曲线，精准量化了不同MOI下噬菌体的裂解效率与抑菌效果。通过生长曲线的直接对比，明确了MOI 0.1为噬菌体的最佳作用浓度，为后续生物膜实验、鸡肉应用实验的噬菌体浓度设置提供了直接的量化依据。
实现多组样本标准化同步培养，保障实验结果的严谨性与可重复性
本实验需同时完成数十个平行样本的培养与检测，传统手动摇瓶培养、单点OD检测方法，易出现环境条件波动、人为操作误差导致的结果偏差。Bioscreen C仪器的100孔蜂窝板培养体系，可同时完成多组样本的平行培养，精准控制42℃恒温、220 rpm持续震荡的培养条件，完美匹配弯曲杆菌的生长需求，消除了环境因素波动的干扰；同时自动化连续检测避免了手动取样带来的样本污染与检测误差，保障了不同处理组数据的平行性、可比性与可重复性，让“噬菌体CC_R7对宿主菌具有高效裂解活性”的核心结论更加严谨可靠。
动态捕捉细菌全周期生长特征，揭示噬菌体裂解时效与宿主菌抗性规律
与传统终点法检测不同，Bioscreen C仪器可实时记录细菌从接种、滞后期、指数生长期到平台期的完整生长动力学过程，捕捉到传统方法无法识别的精细时效特征。通过24 h连续监测，研究不仅证实了噬菌体12 h内的强效抑菌作用，还发现宿主菌在21 h后出现轻微再生长，推测为噬菌体抗性自发突变导致。这种全周期的生长动力学监测，完整呈现了噬菌体裂解作用的全过程，既明确了最佳抑菌时效，也为后续噬菌体抗性防控、鸡尾酒配方研发提供了关键实验依据。
建立标准化噬菌体裂解活性检测体系，为后续研究提供统一实验平台
本研究中Bioscreen C仪器建立的噬菌体液体裂解活性检测体系，具备标准化、高通量、高重复性的特点，不仅完成了CC_R7的裂解活性评估，还为后续噬菌体鸡尾酒筛选、协同抑菌物质验证、不同噬菌体菌株活性对比等研究，提供了统一、可靠的实验平台与检测方法，保障了不同实验阶段结果的一致性与可追溯性。