Antioxidant properties and molecular mechanisms of Lactiplantibacillus plantarum ZJ316: A potential probiotic resource
植物乳植杆菌ZJ316的抗氧化特性与分子机制：一种极具潜力的益生菌资源
来源：LWT - Food Science and Technology 187 (2023) 115269
论文整体总结
该论文发表于2023年《LWT - Food Science and Technology》，以分离自健康婴儿粪便的植物乳植杆菌ZJ316（L. plantarum ZJ316）为研究对象，针对该菌株已被证实的抑菌、抗炎等益生特性，但其抗氧化活性与分子机制尚不明确的研究空白，系统评价了菌株的抗氧化能力、益生菌特性与生物安全性，并深入解析了其抗氧化的分子机制。研究发现，该菌株对H₂O₂具有极强的耐受性，可耐受2.5 mmol/L H₂O₂胁迫，其完整菌体与发酵上清液均具备优异的多类型自由基清除能力，细胞匀浆和发酵上清液中均检测到高活性的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及总抗氧化能力（T-AOC）。基因组PCR证实该菌株携带8个核心抗氧化相关基因，RT-qPCR结果显示，H₂O₂胁迫下菌株可通过对数期和稳定期不同抗氧化基因的有序表达，精准调控胞内氧化还原稳态。同时，该菌株具备良好的细胞表面疏水性与Caco-2细胞黏附能力，无溶血活性，对欧洲食品安全局（EFSA）推荐的7种抗生素敏感，具备优异的生物安全性。该研究首次系统解析了植物乳植杆菌ZJ316的抗氧化特性与转录调控机制，证实其是一种极具开发潜力的抗氧化型益生菌，为其在功能食品中的开发与应用提供了全面的理论支撑与实验依据。
1. 论文摘要内容
氧化应激是多种癌症的标志性特征，而具备抗氧化特性的益生菌已被证实可缓解机体氧化应激。植物乳植杆菌ZJ316是一株性能优异的菌株，展现出极强的过氧化氢（H₂O₂）耐受性，对EFSA推荐的氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素7种抗生素均敏感，同时具备良好的细胞疏水性和Caco-2细胞黏附能力，但其抗氧化作用机制尚不明确。本研究发现，L. plantarum ZJ316可耐受2.5 mmol/L的H₂O₂，其完整菌体和发酵上清液均表现出强大的自由基清除能力；此外，该菌株的细胞匀浆和发酵上清液均表现出较高的抗氧化酶活性。同时，L. plantarum ZJ316中抗氧化基因的mRNA水平可有序调控细胞氧化还原稳态，从转录水平揭示了该菌株的抗氧化机制。综上，L. plantarum ZJ316具备良好的黏附能力和抗氧化特性，无溶血活性，不存在耐药性转移风险，表明该菌株有望作为氧化还原调控型益生菌应用于功能食品开发中。
2. 论文关键词
植物乳植杆菌ZJ316、益生菌、安全性评价、抗氧化活性、抗氧化基因
3. 研究目的
1. 系统评价植物乳植杆菌ZJ316对H₂O₂的耐受能力，筛选其抗氧化潜力，明确该菌株对多种活性氧自由基的体外清除能力。
2. 测定该菌株的抗氧化酶活性，包括SOD、GSH-Px及总抗氧化能力，从酶学层面解析其抗氧化作用的物质基础。
3. 验证该菌株中核心抗氧化相关基因的存在，解析H₂O₂胁迫下，菌株在对数生长期和稳定期抗氧化基因的转录表达规律，从分子层面揭示其抗氧化的转录调控机制。
4. 全面评估该菌株的益生菌特性，包括细胞表面疏水性、肠道上皮细胞黏附能力，同时开展抗生素敏感性、溶血活性检测，验证其作为益生菌的生物安全性。
5. 整合表型、酶学、基因层面的研究结果，系统阐明植物乳植杆菌ZJ316的抗氧化特性与分子机制，为其作为抗氧化型益生菌在功能食品中的开发与应用提供理论依据和实验支撑。
4. 研究思路
1. 抗氧化潜力初筛：通过Bioscreen实验，对比5株乳酸菌在不同浓度H₂O₂胁迫下的存活率，筛选出H₂O₂耐受性最强的植物乳植杆菌ZJ316作为核心研究对象；进一步通过梯度浓度H₂O₂下的生长曲线测定，明确该菌株的H₂O₂耐受极限。
2. 益生菌特性与安全性评价：通过有机溶剂结合法测定菌株的细胞表面疏水性，Caco-2细胞黏附实验结合革兰氏染色镜检，评估菌株的肠道黏附能力；通过血琼脂平板培养检测溶血活性，微量肉汤稀释法测定菌株对10种抗生素的最低抑菌浓度（MIC），依据EFSA标准评估其抗生素敏感性与生物安全性。
3. 体外抗氧化活性系统评价：以益生菌金标准菌株鼠李糖乳杆菌GG为对照，分别测定植物乳植杆菌ZJ316完整菌体和发酵上清液对DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除能力，全面评估其体外自由基清除活性。
4. 抗氧化酶活性检测：利用商业化试剂盒，分别测定菌株细胞匀浆和发酵上清液中的SOD、GSH-Px活性，同时通过ABTS和FRAP两种方法测定总抗氧化能力（T-AOC），从酶学层面解析其抗氧化的物质基础。
5. 抗氧化相关基因的克隆与验证：根据菌株全基因组序列，设计8个核心抗氧化相关基因的特异性引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，验证菌株基因组中抗氧化基因的存在，并通过测序比对确认基因序列的准确性。
6. 抗氧化基因的转录调控机制解析：设置梯度浓度H₂O₂胁迫，分别收集菌株对数生长期和稳定期的菌体，通过RT-qPCR技术，检测8个抗氧化基因的相对表达水平，解析不同生长阶段、不同氧化胁迫强度下，菌株抗氧化基因的表达规律与转录调控机制。
7. 结果整合与结论总结：整合菌株H₂O₂耐受性、自由基清除能力、抗氧化酶活性、基因转录调控规律及安全性评价结果，系统阐明植物乳植杆菌ZJ316的抗氧化特性与分子机制，明确其作为抗氧化型益生菌的开发潜力与应用前景。
5. 研究亮点
1. 首次系统解析了植物乳植杆菌ZJ316的抗氧化特性与分子机制，填补了该菌株已被证实的抑菌、抗炎益生特性之外，抗氧化功能与作用机制的研究空白，完善了该菌株的益生功能图谱。
2. 发现该菌株具备极强的H₂O₂耐受能力，可在2.5 mmol/L H₂O₂胁迫下完成正常生长，其耐受能力显著优于已报道的多数抗氧化型乳酸菌，为高氧化胁迫环境下的益生菌应用提供了优质候选菌株。
3. 从表型-酶学-基因三个层面构建了完整的抗氧化机制解析体系，不仅证实了菌株的自由基清除能力和高活性抗氧化酶系，还首次揭示了该菌株通过对数期和稳定期不同抗氧化基因的有序、分阶段表达，精准调控胞内氧化还原稳态的转录调控机制。
4. 全面验证了菌株的益生菌特性与生物安全性，证实该菌株具备与鼠李糖乳杆菌GG相当的Caco-2细胞黏附能力，无溶血活性，对EFSA推荐的7种抗生素均敏感，不存在获得性耐药与耐药基因转移风险，为其在食品中的应用扫清了安全性障碍。
5. 证实了该菌株同时具备菌体细胞和发酵代谢产物双重抗氧化活性，其完整菌体和发酵上清液分别对不同类型自由基具备特异性清除能力，为其活菌制剂和后生元产品的双向开发提供了实验依据。
6. 首次在该菌株中验证了8个核心抗氧化基因的完整存在与功能响应，包括常规乳酸菌中罕见的过氧化氢酶编码基因cat，解释了其高H₂O₂耐受性的核心遗传基础，为乳酸菌抗氧化机制的菌株特异性研究提供了新的参考。
6. 可延伸的方向
1. 体内抗氧化活性与作用机制的深度验证：通过D-半乳糖致衰老、化学物质致氧化损伤等动物模型，系统评价该菌株在体内的抗氧化效果，解析其对宿主肠道菌群、内源性抗氧化系统、氧化应激相关信号通路的调控机制，明确其体内抗氧化的作用靶点。
2. 抗氧化活性物质的分离鉴定与功能验证：对该菌株发酵上清液中的抗氧化活性物质（如胞外多糖、生物活性肽、酚类代谢物等）进行分离、纯化与结构鉴定，明确各活性组分的抗氧化贡献，为其后生元产品的开发提供物质基础。
3. 功能食品的开发与应用研究：开发该菌株的活菌制剂、发酵乳、微胶囊包埋产品等功能性食品，优化发酵工艺与储存条件，评估产品在货架期内的活菌稳定性与抗氧化活性，推动其产业化应用。
4. 特定疾病模型中的应用潜力研究：在溃疡性结肠炎、神经退行性疾病、糖尿病等氧化应激相关疾病模型中，评价该菌株的干预效果，明确其在疾病辅助治疗中的应用潜力，拓展其益生功能的应用场景。
5. 抗氧化基因的功能验证与菌株改造：通过基因敲除/过表达技术，验证8个抗氧化基因在菌株氧化应激耐受中的具体功能，解析基因间的协同调控网络；通过基因工程改造，进一步提升菌株的抗氧化能力与环境抗逆性。
6. 与其他益生菌/益生元的协同作用研究：探究该菌株与其他益生菌、益生元、植物提取物的协同抗氧化效果，优化复合益生菌配方，开发抗氧化效果更优的复合制剂。
7. 加工过程中的抗逆性研究：评估该菌株在食品热加工、胃酸、胆盐等胁迫条件下的存活能力与抗氧化活性稳定性，为其在不同食品体系中的应用提供工艺优化依据。
7. 测量的数据、对应图表及研究意义
1. 5株乳酸菌在不同浓度H₂O₂胁迫下的存活率数据，对应Fig 1A
数据内容：植物乳植杆菌ZJ316、鼠李糖乳杆菌GG、清酒乳杆菌LZ217、副干酪乳杆菌ZFM54、鼠李糖乳杆菌ZFM202在0.4 mmol/L、0.7 mmol/L H₂O₂胁迫下的存活率，其中ZJ316在0.4 mmol/L和0.7 mmol/L H₂O₂下存活率分别达88.1%和92.39%，显著高于其他4株菌株。
研究意义：完成了抗氧化潜力菌株的初筛，直接证实植物乳植杆菌ZJ316在受试菌株中具备最强的H₂O₂耐受能力，为后续以该菌株为核心的抗氧化机制研究提供了核心筛选依据，明确了研究对象的选择合理性。
2. 不同浓度H₂O₂胁迫下植物乳植杆菌ZJ316的生长密度动态数据，对应Fig 1B
数据内容：0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L H₂O₂胁迫下，0-24 h内菌株OD600的动态变化，2.5 mmol/L H₂O₂下菌株生长速率虽有所降低，但24 h仍能达到正常生长水平。
研究意义：明确了植物乳植杆菌ZJ316的H₂O₂耐受极限，证实其可耐受2.5 mmol/L的高浓度H₂O₂胁迫，其耐受能力显著优于已报道的多数乳酸菌菌株，直观量化了该菌株的抗氧化胁迫能力，为后续氧化胁迫实验的浓度设置提供了直接依据。
3. 植物乳植杆菌ZJ316的细胞表面疏水性数据，对应Fig 1C
数据内容：菌株对二甲苯、氯仿、正己烷、乙酸乙酯四种有机溶剂的黏附率，分别为18.50%、34.48%、7.53%、18.11%。
研究意义：证实该菌株具备良好的细胞表面疏水性，而疏水性是益生菌肠道黏附、定植能力的核心指标之一，为该菌株的肠道定植潜力提供了表型证据，进一步支撑了其益生菌特性。
4. 植物乳植杆菌ZJ316对Caco-2细胞的黏附率数据，对应Fig 1D、Fig 1E
数据内容：菌株与Caco-2细胞共孵育1 h和2 h后的黏附率，分别为7.80%和13.32%，与益生菌金标准菌株鼠李糖乳杆菌GG（8.00%、13.90%）相当；同时包含革兰氏染色后菌株黏附Caco-2细胞的显微图像。
研究意义：直接证实该菌株具备优异的肠道上皮细胞黏附能力，而黏附是益生菌在肠道内定植、发挥益生作用的核心前提，验证了该菌株在宿主肠道内发挥抗氧化等益生功能的可行性，同时通过显微图像直观呈现了菌株的细胞黏附表型。
5. 植物乳植杆菌ZJ316的溶血活性检测结果，对应Fig 1F
数据内容：菌株在5%脱纤维绵羊血琼脂平板上培养48 h后，呈现γ-溶血（无溶血环、培养基无变化）。
研究意义：证实该菌株无溶血活性，而溶血活性是益生菌安全性评价的核心指标，排除了菌株的潜在毒力风险，为其作为食品级益生菌的安全性提供了关键实验证据。
6. 植物乳植杆菌ZJ316完整菌体与发酵上清液的DPPH自由基清除活性数据，对应Fig 2A
数据内容：菌株发酵上清液（ZJ316 FS）的DPPH自由基清除率达99.02%，完整菌体（ZJ316）清除率为59.82%，与鼠李糖乳杆菌GG的完整菌体和发酵上清液活性相当。
研究意义：证实该菌株的发酵上清液具备极强的DPPH自由基清除能力，完整菌体也具备良好的清除活性，明确了其氢供体能力，是其抗氧化活性的核心表型证据之一，同时证实其代谢产物是自由基清除的重要物质基础。
7. 植物乳植杆菌ZJ316完整菌体与发酵上清液的ABTS自由基清除活性数据，对应Fig 2B
数据内容：菌株完整菌体的ABTS自由基清除率达61.28%，发酵上清液清除率为2.98%，而鼠李糖乳杆菌GG完整菌体清除率低于ZJ316。
研究意义：明确了该菌株完整菌体是ABTS自由基清除的主要载体，与DPPH清除的活性分布形成互补，证实该菌株可通过菌体细胞和代谢产物分别靶向清除不同类型的自由基，全面解析了其自由基清除的作用特征。
8. 植物乳植杆菌ZJ316完整菌体与发酵上清液的羟自由基清除活性数据，对应Fig 2C
数据内容：菌株完整菌体的羟自由基清除率为25.43%，发酵上清液清除率为11.76%，均显著高于鼠李糖乳杆菌GG的完整菌体（19.37%）和发酵上清液（5.29%）。
研究意义：羟自由基是对生物大分子损伤最强的活性氧，该结果证实该菌株对羟自由基具备优异的清除能力，显著优于益生菌金标准菌株，直接支撑了其缓解氧化应激损伤的核心潜力。
9. 植物乳植杆菌ZJ316完整菌体与发酵上清液的超氧阴离子自由基清除活性数据，对应Fig 2D
数据内容：菌株发酵上清液和完整菌体的超氧阴离子自由基清除率分别为25.01%和21.99%，完整菌体清除率较鼠李糖乳杆菌GG高出12.02%。
研究意义：超氧阴离子是生物体内源性活性氧的核心类型，该结果证实该菌株可有效清除超氧阴离子，从源头阻断活性氧的链式反应，进一步完善了其全谱系的自由基清除能力评价。
10. 植物乳植杆菌ZJ316的抗氧化酶活性与总抗氧化能力数据，对应Table 4
数据内容：菌株细胞匀浆中SOD活性为14.35±3.00 U/mgprot，发酵上清液中为23.05±0.18 U/mL；细胞匀浆中GSH-Px活性为26.25±0.44 U/mgprot，发酵上清液中为21.05±0.27 U/mL；同时包含ABTS和FRAP法测定的细胞匀浆与发酵上清液的总抗氧化能力（T-AOC）数值。
研究意义：从酶学层面揭示了该菌株抗氧化活性的核心物质基础，证实其可通过分泌SOD、GSH-Px等核心抗氧化酶，直接清除活性氧、维持胞内氧化还原稳态，为其自由基清除能力提供了直接的酶学解释，同时证实其菌体和代谢产物均具备完整的抗氧化酶系。
11. 植物乳植杆菌ZJ316抗氧化相关基因的PCR扩增验证结果，对应Fig 3
数据内容：8个抗氧化相关基因（Gpx、gshR1、gshR2、gshR3、gshR4、cat、nox、npx）的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果，8个基因均扩增出与预期长度相符的特异性条带。
研究意义：首次在基因组层面证实该菌株携带8个核心抗氧化相关基因，包括过氧化氢酶基因cat、谷胱甘肽过氧化物酶基因Gpx、NADH过氧化物酶基因npx等，为其高H₂O₂耐受性和抗氧化活性提供了遗传基础，也为后续转录水平的机制研究提供了基因靶点。
12. H₂O₂胁迫下植物乳植杆菌ZJ316对数生长期抗氧化相关基因的相对mRNA表达水平数据，对应Fig 4A
数据内容：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L H₂O₂胁迫下，菌株对数生长期8个抗氧化基因（nox、Gpx、cat、npx、gshR1、gshR2、gshR3、gshR4）的相对表达量变化，不同基因呈现出差异化的表达规律。
研究意义：揭示了对数生长期菌株应对不同强度氧化胁迫的转录调控策略，轻度氧化胁迫下nox、npx、gshR3上调发挥抗氧化作用，高强度氧化胁迫下Gpx、gshR1、gshR2显著上调，cat基因则全程响应氧化胁迫，从转录水平解析了菌株对数期的抗氧化调控机制。
13. H₂O₂胁迫下植物乳植杆菌ZJ316稳定期抗氧化相关基因的相对mRNA表达水平数据，对应Fig 4B
数据内容：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L H₂O₂胁迫下，菌株稳定期8个抗氧化基因的相对表达量变化，基因表达水平与H₂O₂浓度呈正相关，高浓度H₂O₂下多数基因显著上调。
研究意义：明确了稳定期菌株应对氧化胁迫的转录调控特征，与对数生长期的分阶段调控模式不同，稳定期菌株在高浓度H₂O₂下通过nox、Gpx、cat、gshR2、gshR4等多个基因的同步上调应对氧化胁迫，完整揭示了菌株在不同生长阶段，通过抗氧化基因的有序表达调控胞内氧化还原稳态的核心分子机制。
14. 植物乳植杆菌ZJ316对10种抗生素的最低抑菌浓度（MIC）与敏感性数据，对应Table 3
数据内容：菌株对庆大霉素、克林霉素、氨苄西林、卡那霉素、红霉素、四环素、氯霉素7种EFSA推荐抗生素的MIC值均低于敏感性断点，判定为敏感；对万古霉素表现出植物乳杆菌固有耐药性，对链霉素、泰乐菌素无判定标准。
研究意义：依据EFSA标准完成了菌株的抗生素敏感性评价，证实该菌株对7种核心抗生素均敏感，不存在获得性耐药，无耐药基因水平转移的风险，结合无溶血活性的结果，全面验证了该菌株作为食品级益生菌的生物安全性。
15. 抗氧化相关基因的引物序列、基因描述与ORF长度数据，对应Table 1
数据内容：8个抗氧化相关基因的PCR引物序列、基因功能描述、基因组定位、ORF长度信息。
研究意义：为抗氧化基因的克隆、表达检测提供了核心实验材料，确保了基因扩增和RT-qPCR实验的准确性与可重复性，为后续该菌株抗氧化基因的功能研究提供了引物参考。
16. RT-qPCR所用的引物序列数据，对应Table 2
数据内容：16S rRNA内参基因和8个抗氧化相关基因的RT-qPCR上下游引物序列。
研究意义：为菌株抗氧化基因的转录水平定量检测提供了核心引物信息，保证了RT-qPCR实验的准确性，为转录调控机制的解析提供了方法学支撑，也为后续相关研究提供了可复用的引物序列。
8. 研究结论
1. 分离自健康婴儿粪便的植物乳植杆菌ZJ316具备极强的H₂O₂耐受能力，可耐受2.5 mmol/L的高浓度H₂O₂胁迫，其耐受能力显著优于多数已报道的乳酸菌菌株。
2. 该菌株具备全谱系的体外自由基清除能力，其完整菌体和发酵上清液可有效清除DPPH、ABTS、羟自由基、超氧阴离子等多种活性氧自由基，其中发酵上清液的DPPH清除率达99.02%，完整菌体的羟自由基、超氧阴离子清除能力显著优于益生菌金标准菌株鼠李糖乳杆菌GG。
3. 该菌株的细胞匀浆和发酵上清液中均检测到高活性的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），同时具备极强的总抗氧化能力，这些抗氧化酶系是其发挥抗氧化活性的核心物质基础。
4. 该菌株基因组中携带Gpx、cat、npx、nox、gshR1、gshR2、gshR3、gshR4共8个核心抗氧化相关基因；在H₂O₂胁迫下，菌株可通过对数生长期和稳定期抗氧化基因的差异化、有序表达，精准调控胞内氧化还原稳态，这是其抗氧化活性的核心分子机制。
5. 该菌株具备良好的益生菌特性，细胞表面疏水性优异，对Caco-2细胞的黏附能力与鼠李糖乳杆菌GG相当；同时具备优异的生物安全性，无溶血活性，对EFSA推荐的7种抗生素均敏感，不存在耐药性转移风险。
6. 综上，植物乳植杆菌ZJ316是一株具备优异抗氧化特性、良好益生特性与可靠生物安全性的益生菌菌株，有望作为氧化还原调控型益生菌，广泛应用于功能食品的开发中。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义详细解读
本研究中，芬兰Bioscreen C全自动微生物生长分析仪是核心的菌株抗氧化潜力初筛与表型验证工具，主要应用于两大核心实验：一是5株受试乳酸菌在0、0.4、0.7 mmol/L H₂O₂胁迫下的存活率测定，完成抗氧化潜力菌株的初筛；二是植物乳植杆菌ZJ316在0.5-2.5 mmol/L梯度浓度H₂O₂胁迫下的全周期生长曲线测定，明确菌株的H₂O₂耐受极限。实验均采用无菌MRS培养基体系，37℃恒温培养，固定时间间隔检测OD600值，设置3个生物学重复。该仪器生成的生长曲线与存活率数据，是本研究的立论基础，其具体研究意义可分为以下6个层面：
1. 实现了多菌株抗氧化潜力的高通量、平行化筛选，锁定了核心研究对象
Bioscreen仪器的100孔板体系可同时完成多菌株、多浓度梯度的平行培养与检测，本研究中同步完成了5株乳酸菌在3个H₂O₂浓度下的生长状态监测，仅通过一次实验就完成了抗氧化潜力菌株的初筛，直接锁定了H₂O₂耐受性最强的植物乳植杆菌ZJ316作为核心研究对象。相比传统的试管培养、人工定时取样检测的方法，该仪器的高通量特性大幅提升了菌株筛选的效率，同时保证了所有受试菌株的培养环境完全一致，消除了批次间的环境误差，确保了菌株间耐受性对比结果的真实性与可靠性，为整个研究的开展奠定了核心的菌株筛选基础。
2. 精准量化了植物乳植杆菌ZJ316的H₂O₂耐受能力，明确了其抗氧化胁迫的极限阈值
通过Bioscreen仪器连续24 h的动态OD600检测，研究完整捕捉了植物乳植杆菌ZJ316在0.5-2.5 mmol/L梯度浓度H₂O₂胁迫下的全生长周期动态，从迟滞期、对数期到稳定期的生长变化被完整记录。通过生长曲线，研究明确了该菌株可耐受2.5 mmol/L的高浓度H₂O₂，即使在该浓度下，菌株24 h仍能达到正常的生长密度，这一耐受能力显著优于已报道的多数抗氧化型乳酸菌（如植物乳杆菌KCC-24仅能耐受1.5 mmol/L H₂O₂，植物乳杆菌Y44在1.0 mmol/L H₂O₂下存活率仅55%）。Bioscreen的高时间分辨率检测，精准量化了不同H₂O₂浓度对菌株生长速率、迟滞期时长的影响，明确了菌株抗氧化胁迫的剂量效应与极限阈值，为后续体外抗氧化实验、氧化胁迫下的基因表达实验的H₂O₂浓度设置提供了直接、精准的依据。
3. 保证了氧化胁迫实验中培养环境的高度一致性，消除了系统误差，确保了实验结果的特异性
H₂O₂易分解、易受环境温度和震荡条件影响，传统的摇瓶培养、人工取样检测会因开盖取样导致H₂O₂挥发分解、培养温度波动、溶氧变化，直接影响氧化胁迫的稳定性，造成实验结果偏差。而Bioscreen仪器的封闭式检测体系、全程恒温控制、同步轨道震荡模式，保证了整个培养周期内，所有实验组的温度、溶氧、震荡频率完全一致，且无需开盖取样，避免了H₂O₂的分解损失，确保了整个培养周期内氧化胁迫强度的稳定性。这一特性彻底消除了环境因素对实验结果的干扰，证实了菌株生长状态的变化完全来源于H₂O₂的氧化胁迫，而非培养环境的波动，为菌株H₂O₂耐受能力的评价提供了严谨的方法学保障。
4. 实现了无人值守的连续自动化检测，保证了生长曲线的完整性与数据的连续性
细菌对H₂O₂胁迫的生长响应是一个动态过程，尤其是对数生长期的生长速率变化，需要高频次的时间节点检测才能完整捕捉。传统的人工检测不仅耗时耗力，无法实现24 h内的高频次连续检测，还会因夜间无法取样导致生长曲线关键节点的缺失。Bioscreen仪器可实现全自动、无人值守的连续检测，可自定义15分钟级别的检测间隔，完整捕捉了菌株在24 h内的生长动态，尤其是H₂O₂胁迫下菌株迟滞期延长、对数期生长速率变化的关键细节，生成的生长曲线具备极高的时间分辨率和完整性。这些连续的动态数据，不仅直观呈现了菌株的H₂O₂耐受表型，还为后续分析菌株应对氧化胁迫的生长策略提供了完整的动力学数据支撑。
5. 建立了乳酸菌抗氧化潜力筛选的标准化生长检测方法，为后续相关研究提供了可复用的技术体系
本研究基于Bioscreen仪器建立的乳酸菌H₂O₂耐受性评价方法，实现了菌株培养、生长检测、存活率计算的全流程标准化。该方法可直接拓展至其他乳酸菌、益生菌的抗氧化潜力高通量筛选、氧化胁迫响应评价、抗氧化物质活性检测等研究场景，解决了传统方法中菌株抗氧化筛选通量低、重复性差、环境干扰大的痛点，为益生菌抗氧化功能的筛选与评价提供了一套标准化、可复用的技术方案。
6. 为菌株的实际应用场景提供了关键的抗逆性数据支撑
益生菌在食品加工、胃酸胆盐胁迫、宿主肠道氧化应激环境中，均会面临不同程度的氧化胁迫，菌株的H₂O₂耐受能力直接决定了其在实际应用中的存活能力与益生功能发挥。Bioscreen仪器生成的生长曲线数据，证实了植物乳植杆菌ZJ316在高浓度氧化胁迫下仍能保持正常生长，具备极强的抗氧化抗逆性，这意味着该菌株在食品加工储存、宿主肠道高氧化应激环境中，仍能保持活菌状态与益生功能，为其作为抗氧化型益生菌在功能食品中的开发与应用，提供了关键的抗逆性数据支撑。