Production of polyhydroxybutyrate from wheat straw hydrolysate using a low-salt requiring and alkaliphilic Halomonas nigrificans X339 under non-sterile open condition
低需盐嗜碱黑生盐单胞菌 X339 在非无菌开放条件下利用小麦秸秆水解物生产聚羟基丁酸酯
来源：Bioresource Technology 424 (2025) 132276
1. 论文摘要
利用农业废弃物生产生物基产品是降低其生产成本的可持续途径。本研究报道了一株新型嗜盐嗜碱菌株 —— 黑生盐单胞菌（Halomonas nigrificans）X339，该菌株具备利用多种低成本碳源的优异能力。与其他嗜盐菌相比，X339 的最适生长盐度可低至 2%（w/v），且能在胞内积累超大尺寸的聚羟基丁酸酯（PHB）颗粒。在开放批次发酵中，X339 以小麦秸秆水解物（WSH）为底物，在 3% 盐度、pH 9 的条件下可合成 5.11 g/L 的 PHB，PHB / 碳源转化率达 0.30 g/g，这是目前已报道的嗜盐菌通过摇瓶发酵利用秸秆水解物生产 PHB 的最高产量。此外，本研究完成了 X339 的全基因组测序，鉴定了其碳源利用相关的关键基因与通路。研究结果为下一代工业生物技术开发了适配的优良底盘菌株，也为生物基产品的生产提供了可持续、环境友好的解决方案。
2. 论文关键词
聚羟基脂肪酸酯、小麦秸秆、盐单胞菌、低需盐特性
3. 研究目的
① 破解现有工业盐单胞菌普遍存在的高盐需求瓶颈，筛选兼具低需盐、嗜碱特性的新型盐单胞菌菌株，降低发酵过程的盐添加成本与高盐废水处理压力。
② 解决木质纤维素类农业废弃物（小麦秸秆）转化生产 PHB 过程中，菌株底物利用效率低、非无菌开放条件下产量不足的行业痛点，实现小麦秸秆水解物向 PHB 的高效生物转化。③ 系统表征菌株的生理特性、碳源利用谱、PHB 合成能力，完成全基因组测序与代谢通路解析，阐明菌株高效合成 PHB、适配开放发酵的分子机制。
④ 验证菌株在非无菌开放条件下利用小麦秸秆水解物生产 PHB 的稳定性与效率，开发一种低成本、低能耗、绿色环保的 PHB 生产技术体系，为下一代工业生物技术提供优良的微生物底盘。
4. 研究思路
① 菌株的分离筛选与分类鉴定：从内蒙古胡同查干苏打湖的卤水样品中分离嗜盐菌株，通过 16S rRNA 测序、系统发育树构建、全基因组平均核苷酸一致性（ANI）分析，完成菌株的分类学鉴定，确定其为 Halomonas nigrificans X339。
② 菌株生理特性的系统表征：利用芬兰 Bioscreen C 全自动微生物生长曲线分析仪，测定菌株在 0~20% NaCl 浓度、pH 5.5~11.0 范围内的生长曲线，明确其最适生长条件与环境耐受范围；同时测定菌株在 26 种不同碳源为唯一底物时的生长动态，完成碳源利用谱的全面分析。③ 菌株 PHB 合成能力的评估与产物表征：以葡萄糖、木糖、乙酸钠等单一 / 混合碳源进行摇瓶发酵，通过气相色谱（GC）定量测定 PHB 产量与含量；利用透射电子显微镜（TEM）观察胞内 PHB 颗粒形态，通过差示扫描量热仪（DSC）、凝胶渗透色谱（GPC）、核磁共振（¹H NMR）完成 PHB 的理化性质与结构表征。④ 非无菌开放发酵的效果验证：以小麦秸秆水解物（WSH）为唯一碳源，在无高温灭菌的开放条件下进行摇瓶发酵，优化 WSH 的稀释倍数；通过定时取样测定发酵过程中的细胞干重、PHB 合成量、底物消耗动态与副产物生成情况；结合宏基因组测序、平板涂布与 16S rRNA 测序，验证开放发酵体系中的菌群纯度与菌株的抗污染能力。⑤ 全基因组测序与代谢通路解析：通过 PacBio 三代测序完成菌株全基因组测序，进行基因预测与功能注释；绘制基因组圈图，预测菌株的碳源代谢通路、PHB 合成关键基因与途径，从基因组层面解释菌株的表型特性与核心优势。
⑥ 结果整合与结论提炼：整合菌株生理特性、发酵性能、基因组分析的全流程结果，明确菌株的工业化应用潜力，总结核心结论并提出后续研究方向。
5. 研究亮点
① 突破了现有工业盐单胞菌的高盐需求瓶颈，分离的 H. nigrificans X339 最适生长盐度低至 2%（w/v），与天然海水盐度高度适配，具备利用海水直接发酵的潜力，可大幅减少工业盐添加量，降低高盐废水处理的环保压力与经济成本。
② 实现了非无菌开放条件下小麦秸秆水解物向 PHB 的高效转化，摇瓶发酵 PHB 产量达 5.11 g/L，碳源转化率 0.30 g/g，是目前已报道的嗜盐菌利用秸秆水解物摇瓶发酵生产 PHB 的最高水平。③ 菌株具备极广的碳源利用谱，可高效利用 23 种低成本碳源，包括木质纤维素来源的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖，以及乙酸、乳酸等有机酸，完美适配农业废弃物水解物的复杂组分，大幅拓展了低成本发酵原料的选择范围。④ 菌株天然合成超大尺寸的 PHB 颗粒（长轴超 1 μm），基因组中缺失编码胞内 PHA 解聚酶的 iPhaZ 基因，可有效避免胞内 PHB 的降解，同时超大颗粒大幅简化了 PHB 下游提取、纯化的工艺流程，显著降低工业化生产成本。⑤ 菌株兼具强嗜碱特性，最适生长 pH 为 8.5~9.0，可直接适配木质纤维素碱法预处理的水解物体系，无需酸碱中和即可直接发酵，减少了工艺步骤与酸碱试剂的消耗，进一步降低了生产成本。
⑥ 菌株在非无菌开放发酵中可占据绝对菌群优势（Halomonas 属占比 97.21%），能有效抵御杂菌污染，无需高温高压灭菌即可实现稳定的 PHB 生产，大幅削减了发酵过程的蒸汽能耗、设备投入与操作成本，完美契合下一代工业生物技术的核心需求。
6. 可延伸的方向
① 菌株的代谢工程定向改造：解析并解除葡萄糖对木糖利用的碳代谢物阻遏（CCR）效应，提升葡萄糖与木糖的共利用效率，进一步提高小麦秸秆水解物向 PHB 的生物转化率；强化 PHB 合成关键基因的表达，进一步提升 PHB 的产量与胞内含量。
② 发酵工艺的放大与优化：开发分批补料发酵、连续发酵工艺，完成从摇瓶到发酵罐的规模放大，优化发酵温度、溶氧、补料策略等参数，提升 PHB 的生产强度与最终产量，实现工业化规模的稳定生产。③ 海水发酵体系的开发与验证：探索菌株利用天然海水替代淡水 + 工业盐进行开放发酵的可行性，评估海水发酵体系的 PHB 生产效率与稳定性，进一步降低发酵过程的淡水资源消耗与原料成本。④ 底盘菌株的产物谱拓展：基于该菌株的优良特性，通过合成生物学与代谢工程改造，拓展其产物合成能力，实现聚羟基脂肪酸酯共聚物、四氢嘧啶、5 - 氨基乙酰丙酸、有机酸等高附加值生物基化学品的合成。⑤ PHB 合成机制的深度解析：深入研究菌株缺失 iPhaZ 基因对 PHB 颗粒形成、分子量分布、材料理化性质的影响，定向调控 PHB 的分子量与材料性能，适配不同的应用场景。⑥ 低成本原料的拓展应用：评估菌株对玉米秸秆、水稻秸秆、农林加工废弃物、工业有机废水等其他低成本木质纤维素类原料的利用能力，进一步拓展发酵原料的适用范围，提升技术的普适性。
⑦ 工业化应用的稳定性评估：开展长期连续开放发酵试验，评估菌株在规模化生产中的遗传稳定性、抗污染能力与生产持续性，建立标准化的工业化生产工艺，为技术的产业化落地提供完整的数据支撑。
7. 测量的数据、对应图表及研究意义
① 菌株分类鉴定与形态学数据
数据内容：基于 16S rRNA 序列构建的系统发育树、全基因组 ANI 分析结果、菌落形态特征、扫描电镜（SEM）观察的菌体形态（杆状，长 1~2.8 μm，宽约 0.8 μm）。
数据来源：Fig 1. Isolation and characterization of H. nigrificans X339. (A) Phylogenetic tree of H. nigrificans X339 and Halomonas representative species based on 16S rRNA gene sequences; (B) Growth of H. nigrificans X339 on LB60 agar plate; (C) SEM image of X339 grown in LB60 medium.
研究意义：明确了菌株 X339 的分类学地位，正式鉴定为黑生盐单胞菌（Halomonas nigrificans），完成了菌株的基础形态学表征，为后续生理特性研究、代谢机制解析与工业化应用提供了核心分类学依据。
② 菌株在不同盐度、pH 下的生长动态数据
数据内容：测定了 0~20%（w/v）NaCl 浓度、pH 5.5~11.0 梯度条件下菌株的全周期生长曲线，明确了菌株的盐度、pH 耐受范围与最优生长条件。
数据来源：Fig 2. Growth curves of H. nigrificans X339 under different NaCl concentrations with pH 8.0 (A) and different pH with 3 % NaCl (B) at 37 °C.
研究意义：证实了菌株 X339 兼具宽盐度适应范围与强嗜碱特性，明确了其低需盐的核心优势，突破了现有工业盐单胞菌高盐需求的限制；同时为后续 PHB 发酵体系的盐度、pH 参数设置，以及适配碱法预处理秸秆水解物体系提供了关键的生理数据支撑。
③ 胞内 PHB 颗粒形态与产物理化性质数据
数据内容：透射电镜（TEM）观察到的胞内超大 PHB 颗粒形态；DSC 分析得到的 PHB 熔融温度（Tm1=136.31℃、Tm2=149.01℃）；GPC 分析得到的 PHB 分子量分布（重均分子量 Mw=327 kDa，数均分子量 Mn=130 kDa，多分散性指数 PDI=2.5）；¹H NMR 证实合成的 PHA 为均聚 PHB。
数据来源：Fig 3. PHA granules of H. nigrificans X339 and thermal property analysis of extracted PHA. (A) TEM photos of samples from the fermentation medium containing 30 g/L glucose at 36 h; (B) PHA extracted from X339 grown with glucose as carbon source; (C) DSC thermograph of the extracted PHA in the second heating process.
研究意义：证实了菌株合成的产物为均聚聚羟基丁酸酯（PHB），明确了其天然合成超大 PHB 颗粒的独特优势；完成了 PHB 的热学性能、分子量分布等材料学特性的全面表征，为 PHB 的下游提取纯化工艺优化、材料化应用场景拓展提供了关键的实验数据。
④ 不同碳源下菌株的 PHB 合成发酵参数数据
数据内容：以葡萄糖、木糖、乙酸钠为单一碳源，及葡萄糖 + 木糖、葡萄糖 + 木糖 + 乙酸钠为混合碳源，进行 48 h 摇瓶发酵，测定的细胞干重（CDW）、PHB 含量、PHB 浓度，以及副产物 α- 酮戊二酸、丙酮酸的产量。
数据来源：Table 1 PHB production of H. nigrificans X339 using different carbon sources.
研究意义：量化了菌株对小麦秸秆水解物核心组分（葡萄糖、木糖、乙酸）的 PHB 转化能力，证实乙酸作为碳源时 PHB 胞内含量可达 61.32 wt%，混合碳源中添加乙酸可使 PHB 产量提升 20%；明确了菌株对不同碳源的代谢偏好，为利用小麦秸秆水解物复合碳源高效生产 PHB 提供了核心发酵参数依据。
⑤ 小麦秸秆水解物开放发酵的动态过程数据
数据内容：15 倍、20 倍、30 倍稀释 WSH 为碳源时，48 h 发酵过程中不同时间点的细胞干重、PHB 含量、PHB 浓度；HPLC 测定的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乳酸、乙酸、甲酸的消耗动态，及副产物 α- 酮戊二酸、丙酮酸的生成动态。
数据来源：Fig 4. PHB production by X339 using WSH and HPLC analysis of sugars and acids in fermentation culture. (A) CDW; (B) PHB content; (C) PHA concentration; (D) Sugars and acids consumption for 15-fold dilution groups of WSH; (E) 20-fold dilution group; (F) 30-fold dilution group; (G) α-ketoglutarate production; (H) pyruvate production.
研究意义：确定了 WSH 为碳源时的最优稀释倍数为 20 倍，该条件下 PHB 产量达 5.11 g/L，刷新了嗜盐菌利用秸秆水解物摇瓶发酵的产量纪录；明确了菌株对 WSH 中各类碳源的利用规律，证实了葡萄糖对木糖利用的碳代谢物阻遏效应，为后续发酵工艺优化、代谢工程改造提供了直接的数据支撑。
⑥ 开放发酵体系的微生物群落结构数据
数据内容：开放发酵 48 h 培养液的宏基因组测序结果（Halomonas 属占比 97.21%）；不同稀释倍数发酵液涂布平板的菌落形态；随机挑取 20 个单菌落的 16S rRNA 测序鉴定结果。
数据来源：Fig 5. Microbial community distribution in open fermentation culture of H. nigrificans X339 using WSH. (A) Metagenomic analysis of the microbial community distribution in 48-h culture; (B) Culture plated with a 10⁴-fold dilutions on LB30 agar plate; (C) 10⁵-fold dilutions on LB30 agar plate.
研究意义：直接证实了菌株 X339 在非无菌开放发酵中可占据绝对菌群优势，能有效抵御杂菌污染，无需高温灭菌即可实现 PHB 的稳定生产；验证了其作为下一代工业生物技术底盘菌株的核心优势，为低能耗开放发酵工艺的开发提供了关键证据。
⑦ 菌株全基因组特征与代谢通路数据
数据内容：全基因组测序结果（全长 4.43 Mb，GC 含量 53%，编码 3954 个基因）、基因组圈图、COG 功能基因注释结果；淀粉、单糖、有机酸、脂肪酸等碳源的代谢通路，及 PHB 合成的关键基因与通路预测结果。
数据来源：Fig 6. The whole genome of H. nigrificans X339 and its PHB synthesis pathway. (A) Circular map of X339 and the subsystem categories of genes annotated in X339; (B) Pathways for the bioconversion of starch, glucose, xylose, arabinose, sucrose, fructose, acetate, and palmitic acid to PHB.
研究意义：完成了菌株的全基因组功能注释，从基因组层面解析了菌株广谱碳源利用、高效 PHB 合成、超大 PHB 颗粒形成的分子机制；明确了碳源代谢与 PHB 合成的关键基因靶点，为后续的代谢工程改造、菌株性能优化提供了完整的基因组学基础。
8. 核心研究结论
① 本研究分离得到一株新型黑生盐单胞菌 Halomonas nigrificans X339，相较于已报道的工业盐单胞菌，该菌株具备显著的应用优势：可在低至 3%（w/v）的 NaCl 浓度（接近天然海水盐度）和 pH 8.5~9.0 的高碱性条件下旺盛生长，具备利用海水进行发酵的潜力，可大幅降低盐添加成本与高盐废水处理压力。
② Halomonas nigrificans X339 具备强大的 PHB 合成能力，以小麦秸秆水解物为唯一碳源进行非无菌开放发酵时，PHB 产量可达 5.11 g/L，生产强度为 0.11 g/L/h，碳源转化率达 0.30 g/g，是目前已报道的嗜盐菌利用秸秆水解物摇瓶发酵生产 PHB 的最高水平。③ 菌株 X339 天然合成超大尺寸的 PHB 颗粒，该特性源于其基因组中缺失编码胞内 PHA 解聚酶的 iPhaZ 基因；超大尺寸的 PHB 颗粒可显著简化 PHB 回收、纯化的下游加工流程，为工业化生物塑料生产提供了突出的成本优势。④ 菌株 X339 具备广谱的碳源代谢灵活性，可高效利用 23 种低成本碳源，同时在非无菌开放发酵条件下可有效抵御杂菌污染，在菌群中占比达 97.21%，这些特性使其成为将农业有机废弃物转化为 PHB 等高附加值生物基产品的优良底盘菌株。
⑤ 菌株 X339 在木糖利用中存在碳代谢物阻遏效应，未来研究可聚焦于该效应的机制解析与改造，提升葡萄糖与木糖的共利用效率，进一步提高纤维素水解物向生物基产品的转化效率。
9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究采用芬兰 Bioscreen C 全自动微生物生长曲线分析仪，系统测定了 Halomonas nigrificans X339 在 0~20%（w/v）NaCl 浓度、pH 5.5~11.0 梯度条件下的生长动态，以及 26 种不同碳源为唯一底物时的生长曲线，培养温度为 37℃，每个实验组设置 5 次技术重复，获得了菌株全周期的高分辨率生长动态数据。这些生长曲线数据是本研究菌株生理特性表征的核心基础，其研究意义体现在以下 8 个关键层面：
① 精准确定了菌株的最优生长条件与环境适应范围，为发酵体系设计提供了核心基础参数
Bioscreen 仪器的高通量、全自动原位检测特性，实现了不同盐度、pH 梯度下菌株生长曲线的同步、连续测定，精准捕捉了菌株在不同环境条件下的迟滞期、对数生长期、平台期等全周期生长特征。通过生长曲线数据，明确了菌株的盐度适应范围为 1~15%（w/v）NaCl，最优生长盐度为 2~7%；pH 适应范围为 6.5~11.0，最适生长 pH 为 8.5~9.0。这些精准的环境参数，直接决定了后续 PHB 发酵体系的盐度、pH 设置，同时证实了菌株低需盐、嗜碱的核心特性，为其适配碱法预处理的小麦秸秆水解物体系、低盐水体发酵提供了最直接的实验依据。
② 完成了菌株广谱碳源利用能力的系统、定量表征，明确了其底物适配范围
本研究通过 Bioscreen 仪器，平行测定了菌株在 26 种不同碳源（单糖、二糖、多糖、有机酸、醇类）为唯一底物时的生长曲线，实现了对菌株碳源利用能力的高通量、标准化筛选。通过生长曲线的最大 OD₆₀₀值、比生长速率、迟滞期等参数，定量评估了菌株对不同碳源的利用效率，证实了菌株可高效利用 23 种低成本碳源，尤其对木质纤维素来源的木糖、阿拉伯糖、纤维二糖，以及乙酸、乳酸等有机酸具备优异的利用能力，甚至部分碳源的利用效率优于葡萄糖。该数据不仅全面揭示了菌株的代谢灵活性，更直接证实了其适配小麦秸秆水解物复杂碳源组分的核心优势，为利用农业废弃物作为低成本发酵原料提供了关键的表型证据。
③ 揭示了菌株对木糖利用的诱导特性，为后续代谢机制解析与工程改造提供了关键线索
Bioscreen 仪器获得的高时间分辨率生长曲线显示，菌株以木糖为唯一碳源时出现了明显的延滞期，而进入对数生长期后可实现快速增殖，这一特征直接揭示了菌株的木糖利用属于诱导型代谢。同时，结合小麦秸秆水解物发酵过程中的底物消耗数据，明确了菌株存在葡萄糖对木糖利用的碳代谢物阻遏（CCR）效应。这些从生长曲线中获得的关键表型特征，为后续全基因组测序中木糖代谢通路的解析、CCR 效应机制的研究，以及通过代谢工程改造提升木糖利用效率提供了明确的研究方向与靶点。
④ 建立了菌株生长特性的标准化评价体系，保障了实验数据的重复性与可比性
Bioscreen 仪器的恒温、同步震荡、原位连续检测的特性，最大程度消除了传统摇瓶培养、手动分光光度计检测过程中，环境温度波动、人为操作误差、批次间差异带来的系统误差。本研究中所有生长曲线的测定均在统一的仪器参数、培养条件下完成，且每个实验组设置了 5 次技术重复，确保了不同盐度、pH、碳源组之间生长数据的可比性、重复性与统计学显著性，为菌株生理特性的结论提供了可靠、标准化的实验数据基础。
⑤ 为菌株的工业化发酵工艺优化提供了关键的生长动力学参数
Bioscreen 仪器获得的生长曲线，可通过微生物生长模型拟合得到菌株的比生长速率、迟滞期、最大生物量等关键生长动力学参数。这些参数是工业化发酵过程中种子培养时间、接种量、发酵周期、补料策略等工艺参数设计的核心依据，可大幅缩短从实验室摇瓶发酵到工业化放大的工艺优化周期，为菌株的规模化应用提供了关键的动力学数据支撑。
⑥ 验证了菌株在极端环境下的生长稳定性，为非无菌开放发酵提供了生理基础
通过 Bioscreen 仪器测定的高 pH、低盐水体下的生长曲线，证实了菌株在 pH 9.0、3% NaCl 的条件下仍能保持旺盛的生长能力，而该环境条件可显著抑制绝大多数中性、嗜酸性杂菌的生长。这一生长特性数据，直接解释了菌株在非无菌开放发酵中可占据绝对菌群优势、抵御杂菌污染的核心机制，为其实现无灭菌开放发酵、降低发酵能耗提供了关键的生理特性支撑。
⑦ 为不同盐单胞菌菌株的性能对比提供了标准化的评价数据
本研究通过 Bioscreen 仪器获得的生长数据，可与已报道的工业盐单胞菌模式菌株（如 H. bluephagenesis TD01）的生长特性进行标准化对比，明确了菌株 X339 在低需盐特性上的显著优势 ——TD01 最适盐度为 5~6%，而 X339 仅为 2%。这种标准化的生长数据对比，清晰凸显了菌株 X339 的核心创新点与应用优势，为其作为下一代工业生物技术新型底盘菌株的定位提供了直接的实验证据。
⑧ 拓展了 Bioscreen 仪器在极端微生物筛选与工业微生物底盘开发中的应用场景传统上 Bioscreen 仪器多用于常规微生物的药敏实验、生长特性测定，本研究将其创新性地应用于嗜盐嗜碱极端微生物的高通量筛选、环境适应性评价、碳源利用谱分析，建立了一套基于 Bioscreen 生长曲线测定的极端工业微生物底盘菌株筛选与评价体系，为同类极端微生物的筛选、生理特性表征与工业应用开发提供了方法学参考，拓展了该仪器在工业生物技术与合成生物学领域的应用边界。