Heterologous overexpression of bacterial hemoglobin VHb improves erythritol biosynthesis by yeast Yarrowia lipolytica
细菌血红蛋白 VHb 异源过表达提升解脂亚罗酵母赤藓糖醇生物合成
来源：Mirończuk et al. Microb Cell Fact (2019) 18:176
摘要
解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）是极具工业潜力的非常规酵母，但其发酵需氧量极高，成为大规模生产的瓶颈。本研究将密码子优化的透明颤菌血红蛋白基因（VHb）在解脂亚罗酵母中过表达，旨在实现低氧条件下以甘油为底物高效生长并合成赤藓糖醇。结果显示，低氧下 VHb 过表达菌株以酵母型细胞形态为主，摇瓶实验中赤藓糖醇效价提升 83%；5L 发酵罐中，工程菌株赤藓糖醇产率（Q_ERY=0.38 g/h）与得率（Y_ERY=0.37 g/g）均显著高于对照菌株（Q_ERY=0.30 g/h、Y_ERY=0.29 g/g），且低搅拌条件下泡沫生成量少。结论表明，VHb 在解脂亚罗酵母中的过表达可实现菌株在低氧下的稳健生长，以低成本底物甘油高效合成高附加值产物赤藓糖醇。
关键词
细菌血红蛋白，透明颤菌血红蛋白，解脂亚罗酵母，甘油，代谢工程
研究目的
探究密码子优化的细菌血红蛋白 VHb 异源过表达，对解脂亚罗酵母在低氧、高渗透压、低 pH 条件下以甘油为底物生长及赤藓糖醇生物合成的影响，解决解脂亚罗酵母发酵高耗氧的工业瓶颈。
研究思路
构建密码子优化的 VHb 过表达重组解脂亚罗酵母菌株；通过 RT-qPCR 验证 VHb 的转录表达；利用芬兰 Bioscreen C 分析仪测定低氧下菌株生长曲线；通过摇瓶与 5L 发酵罐实验，对比野生型与工程菌株的细胞形态、赤藓糖醇合成量、底物利用率及副产物积累；分析发酵参数，明确 VHb 对低氧下赤藓糖醇合成的提升作用。
研究亮点
首次在解脂亚罗酵母中实现密码子优化的 VHb 异源过表达，适配低氧赤藓糖醇合成场景；VHb 可重塑解脂亚罗酵母细胞形态，低氧下维持高产酵母型细胞，抑制菌丝体形成；低氧条件下显著提升赤藓糖醇效价、产率与得率，同时降低发酵搅拌强度，减少泡沫生成，降低工业生产成本；以廉价甘油为底物，实现高附加值赤藓糖醇的高效合成。
可延伸方向
结合适应性实验室进化（ALE）进一步优化 VHb 工程菌株的赤藓糖醇合成能力；将 VHb 过表达策略应用于解脂亚罗酵母的脂质、柠檬酸、α- 酮戊二酸等其他产物合成；探究 VHb 与其他氧调控基因的协同表达，进一步提升低氧适配性；优化发酵工艺，实现 VHb 工程菌株的连续流加赤藓糖醇生产；拓展 VHb 在其他耐胁迫工业酵母中的异源表达应用。
测量数据、对应图表及研究意义
VHb 基因的相对转录水平数据：图 1，验证 VHb 在工程菌株中成功高效转录，证实基因过表达系统的有效性。
低氧条件下野生型与工程菌株的生长曲线数据：图 2，明确 VHb 过表达可提升解脂亚罗酵母在低氧下的生长能力，18h 后工程菌株生长优势显著。
野生型与工程菌株的细胞形态对比数据：图 3，证实 VHb 过表达使菌株在低氧下维持高产酵母型细胞，对照菌株形成大量菌丝体，从细胞形态层面解释产量提升原因。
摇瓶发酵中赤藓糖醇产量随时间变化数据：图 4，量化 VHb 对摇瓶赤藓糖醇合成的提升效果，96h 工程菌株产量较野生型提升 83%。
5L 发酵罐中甘油消耗、生物量积累、赤藓糖醇合成数据：图 5，验证放大发酵条件下 VHb 的增效作用，工程菌株底物利用更快、赤藓糖醇效价更高。
摇瓶与发酵罐中赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇、柠檬酸及生物量产量数据：表 1，系统对比菌株产物合成与生物量积累，明确 VHb 对赤藓糖醇合成的特异性提升，副产物积累无显著增加。
研究结论
密码子优化的 VHb 在解脂亚罗酵母中异源过表达，可显著提升菌株低氧条件下的生长性能；VHb 能调控细胞形态，低氧下维持利于产物合成的酵母型细胞，抑制菌丝体形成；工程菌株在摇瓶与发酵罐中赤藓糖醇效价、产率、得率均显著高于野生型，5L 发酵罐中赤藓糖醇产量达 55.75 g/L；低搅拌强度即可满足工程菌株发酵需求，泡沫生成少，大幅降低工业发酵的能耗与消泡成本；VHb 过表达为解脂亚罗酵母以廉价甘油高效合成赤藓糖醇提供了可行策略，突破高耗氧的工业瓶颈。
芬兰 Bioscreen C 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用 Bioscreen C 全自动生长曲线分析仪，在低氧、甘油为唯一碳源的 YNB 培养基中，每 30min 监测 OD420-600nm，连续测定 48h 生长曲线（图 2），核心研究意义：
精准表征低氧生长表型：高通量、高重复性获取菌株延滞期、对数期生长速率、稳定期生物量，客观反映 VHb 对解脂亚罗酵母低氧耐受与生长的影响，解决传统培养法无法精准量化低氧生长差异的问题。
验证 VHb 的功能表达：18h 后工程菌株 OD 值显著高于野生型，直接证实 VHb 转录后成功翻译并发挥生理功能，改善胞内氧利用效率，支撑菌株在低氧下的高效生长。
关联启动子表达特性：生长曲线差异与 UAS1B_16-TEF 启动子 24h 活性达峰值的特性吻合，为启动子 - 功能基因的适配性提供直接生理数据。
为发酵优化提供基础：明确工程菌株的生长节律，为摇瓶与发酵罐的发酵时间、接种量、供氧条件优化提供精准的动力学依据。
排除背景干扰：在无高渗透压、低 pH 的赤藓糖醇合成胁迫下，单独验证 VHb 对生长的影响，为后续复合胁迫实验提供对照基础。