Integrated downstream processing of Auxenochlorella protothecoides biomass: Pilot scale implementation and biomass fractionation for protein and functional ingredients development
原壳小球藻生物质的集成下游加工：中试规模实施及用于蛋白质和功能成分开发的生物质分馏
来源：Food and Bioproducts Processing 157 (2026) 108–124
1. 摘要
全球对可持续蛋白质来源的需求日益增长，推动了微藻尤其是原壳小球藻的研究，其因高蛋白含量和可利用农业工业副产物的特性备受关注。本研究提出了一种循环生物炼制方法，将原壳小球藻在白葡萄皮渣（WGP）糖源上的异养培养与优化的高压均质（HPH）和先进分馏技术相结合。在中试规模下生产生物质，实现了每克还原糖产出0.47克干重生物质的得率。优化确定HPH参数为210 MPa、6次循环，以最大化细胞破碎和蛋白质溶解效果。下游加工成功分离出三个主要组分：富蛋白提取物、沉淀和生物活性流出液。富蛋白提取物蛋白质含量达46%，氨基酸组成均衡，蛋白质消化率提升至81.5%，起泡和乳化性能优于豌豆蛋白；沉淀蛋白质含量较低（25.5%），富含矿物质和色素；流出液具有抗氧化能力（最高162 mg TEL⁻¹）和广谱抗菌活性。该集成策略实现了食品工业副产物的增值，提高了蛋白质回收率，并生成了适用于食品应用的多功能成分，为循环生物经济框架下可持续替代蛋白的发展提供了支持。
2. 关键词（中文）
循环生物经济、微藻生物炼制、高压均质、副产物增值、蛋白质提取、生物活性成分
3. 研究目的
开发一种集成式的原壳小球藻生物炼制工艺，实现白葡萄皮渣农业副产物的资源化利用，优化高压均质细胞破碎和生物质分馏关键参数，生产高品质的微藻蛋白提取物及其他高附加值功能成分，建立全流程质量平衡并识别工艺瓶颈，为可持续微藻蛋白的工业化生产提供技术支撑和理论依据。
4. 研究思路
首先通过优化的水热处理技术从白葡萄皮渣中提取可发酵糖，作为原壳小球藻异养培养的碳源；在250 L生物反应器中开展中试规模的分批发酵，实时监测生物质干重和还原糖浓度变化，评估培养效率；系统考察不同压力（70、140、210 MPa）和循环次数（1、3、6、9、12次）对高压均质细胞破碎率和蛋白质溶解率的影响，确定最优工艺参数；采用高压均质结合等电点-乙醇共沉淀的集成下游工艺，将生物质分离为富蛋白提取物、沉淀和生物活性流出液三个组分；全面表征各组分的营养组成、氨基酸/脂肪酸谱、色素含量、体外消化率、生物活性（抗氧化、抗菌）及食品加工功能特性；建立从原料到最终产物的全流程质量平衡，量化各步骤的物料损失，明确工艺优化方向。
5. 研究亮点
（1）全链条循环经济模式：将白葡萄皮渣农业废弃物转化为微藻生物质，再通过分级分馏实现所有组分的高值化利用，无废弃物排放，显著提升了工艺的环境可持续性。
（2）中试规模工艺验证：首次在250 L生物反应器中实现了基于白葡萄皮渣糖源的原壳小球藻规模化培养，验证了该培养体系的可放大性和稳定性。
（3）下游工艺创新：将高压均质与等电点-乙醇共沉淀相结合，在高效提取蛋白质的同时，选择性去除叶绿素等色素，获得了浅色、高消化率、功能特性优异的蛋白提取物，解决了微藻蛋白感官品质差的行业痛点。
（4）多产物协同开发：突破了单一蛋白生产的局限，同步获得了富含矿物质和天然色素的沉淀组分，以及具有强抗氧化和广谱抗菌活性的生物活性流出液，大幅提升了生物炼制的经济效益。
（5）系统的应用导向评价：全面评估了各组分的营养品质、生物活性和食品加工适用性，为其在植物基乳制品、烘焙食品、天然防腐剂等不同领域的应用提供了科学依据。
6. 可延伸的研究方向
（1）工艺瓶颈优化：针对生物质收获和蛋白质沉淀两个主要损失环节，开发更高效的固液分离技术（如膜分离、絮凝沉淀），降低工艺损失和能耗；开展连续式高压均质和分馏工艺研究，提升生产效率。
（2）副产物深度开发：对沉淀组分进行酶解或改性处理，开发膳食纤维、天然着色剂或动物饲料添加剂；对生物活性流出液进行柱层析分离纯化，鉴定核心活性成分，开发高纯度天然食品防腐剂或功能性保健品。
（3）产品应用验证：将微藻蛋白提取物应用于植物基奶、植物肉、蛋糕、沙拉酱等具体食品体系，评估其对产品质构、风味、色泽和保质期的影响，开发商业化终端产品。
（4）可持续性评估：开展全生命周期评价（LCA），量化该生物炼制工艺的碳排放、水耗和土地占用，与大豆、豌豆等传统植物蛋白生产工艺进行对比分析；开展技术经济分析（TEA），评估工业化生产的成本和盈利空间。
（5）菌株遗传改良：通过基因编辑或诱变育种技术，培育高蛋白含量、低叶绿素积累、细胞壁更易破碎的原壳小球藻工程菌株，从源头提升工艺效率。
7. 测量的数据及研究意义
（1）中试发酵动力学数据：包括干重生物质和总还原糖浓度随培养时间的变化，来自图2。该数据直观展示了原壳小球藻在白葡萄皮渣糖源上的生长规律和底物利用效率，获得了0.47 g/g的生物质得率和0.55 g/(L·d)的体积生产力，证明了该培养体系的可行性和中试放大潜力。
（2）高压均质工艺参数数据：包括不同压力和循环次数下的蛋白质溶解率、细胞粒径变化，以及70 MPa下的细胞粒径分布，来自图3A、3B、3C。该数据系统揭示了压力和循环次数对细胞破碎效果的影响规律，确定了210 MPa、6次循环的最优工艺参数，为下游蛋白质高效提取提供了技术基础。
（3）各组分生化组成数据：包括粗蛋白、粗脂肪、灰分、碳水化合物及常量/微量元素含量，来自表1。该数据明确了分馏过程对生物质主要成分的分配规律，证明了富蛋白提取物的蛋白质富集效果，以及沉淀组分的矿物质和碳水化合物富集特性，为各组分的定向应用提供了依据。
（4）各组分色素组成数据：包括虾青素、叶黄素、β-胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b及总类胡萝卜素含量，来自表2。该数据揭示了色素在不同组分中的分布特征，表明大部分疏水色素保留在沉淀中，而蛋白提取物色素含量极低，解释了蛋白提取物浅色的原因，同时为沉淀和流出液中色素的回收利用提供了数据支持。
（5）各组分脂肪酸甲酯谱数据，来自表3。该数据表明分馏过程未改变原生物质的脂肪酸组成，其以油酸（~55%）为主的不饱和脂肪酸特征赋予了各组分良好的氧化稳定性和营养价值。
（6）各组分氨基酸组成及蛋白质品质数据：包括必需氨基酸和非必需氨基酸的比例、氨基酸评分（AAS）和必需氨基酸指数（EAAI），来自表4和图5。该数据证明了原壳小球藻蛋白具有均衡的氨基酸组成，符合FAO/WHO的营养标准，其蛋白质品质接近大豆蛋白，是优质的植物蛋白来源。
（7）体外蛋白质消化率数据，来自表5。该数据显示高压均质和分馏处理显著提升了蛋白质消化率，蛋白提取物的消化率达到81.5%，接近酪蛋白水平，解决了微藻蛋白因细胞壁存在导致的消化率低的关键问题。
（8）各组分抗氧化活性数据：包括总酚含量（TPC）、ABTS、FRAP和DPPH自由基清除能力，来自图6。该数据发现蛋白沉淀过程产生的流出液具有最强的抗氧化活性，为该副产物的高值化利用开辟了新方向。
（9）各组分抗菌活性数据：包括琼脂扩散法的定性结果和最低抑菌浓度（MIC）定量结果，来自表S3和表S4。该数据证明流出液对革兰氏阳性和阴性致病菌均具有抑制作用，其MIC值低至12.5 mg/mL，具有作为天然食品防腐剂的开发潜力。
（10）各组分食品加工功能特性数据：包括CIELAB色泽参数、不同pH下的溶解性、起泡能力/稳定性、乳化活性指数和乳化稳定性指数，来自表6和图7。该数据全面评估了各组分的加工适用性，证明蛋白提取物在中性和碱性条件下具有优异的起泡和乳化性能，优于豌豆蛋白，适合应用于多种食品体系。
（11）全流程质量平衡数据，来自图4。该数据量化了从还原糖到各最终产物的转化效率和各步骤的物料损失，识别出生物质收获（57%总损失）和蛋白质沉淀（25%蛋白损失）是当前工艺的主要瓶颈，为后续工艺优化指明了方向。
8. 结论
本研究成功实现了以白葡萄皮渣糖源为碳源的原壳小球藻中试规模异养培养，建立了集成高压均质与等电点-乙醇共沉淀的下游加工工艺，实现了生物质的多组分分馏和全值化利用。优化的高压均质条件（210 MPa、6次循环）有效破碎了微藻细胞，获得的富蛋白提取物蛋白质含量达46%，具有均衡的氨基酸组成、高达81.5%的体外消化率，以及优于豌豆蛋白的起泡和乳化性能。同时，沉淀组分富含镁、钙、锰等矿物质和天然色素，流出液具有显著的抗氧化和广谱抗菌活性，均具有潜在的应用价值。全流程质量平衡分析表明，生物质收获和蛋白质沉淀是当前工艺的主要瓶颈，需进一步优化以提升工业化可行性。该研究为农业副产物的资源化利用和可持续微藻蛋白的工业化生产提供了可行的技术路径和科学依据。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量数据的研究意义
本研究中芬兰Bioscreen C自动生长曲线分析仪被用于测定提取物的最低抑菌浓度（MIC），而非微生物生长曲线（2.3.3.3抗菌能力部分）。具体应用为：将不同浓度（6.25、12.5、25、50 mg/mL）的样品提取物与5种指示菌（沙门氏菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）悬液混合于Bioscreen 96孔板中，在37℃下连续培养24小时，每30分钟自动测定600 nm处的光密度值，绘制细菌生长曲线，以此确定完全抑制细菌生长的最低提取物浓度（MIC）。
该仪器在此处的应用及数据的研究意义主要体现在以下四个方面：
（1）实现抗菌活性的精确定量：相较于传统的琼脂扩散法只能定性或半定量评估抗菌效果，Bioscreen仪器通过连续监测细菌生长动力学，能够准确判定完全抑制细菌生长的最低提取物浓度，获得的MIC数据更具客观性和可比性。本研究通过该方法明确了流出液对蜡样芽孢杆菌的MIC为12.5 mg/mL，对其他致病菌的MIC为25 mg/mL，为不同组分抗菌活性的强弱排序提供了精确的量化依据。
（2）高通量与自动化提升实验效率：Bioscreen系统支持96孔板同时检测，可一次性完成多个样品、多个浓度梯度和多个菌株的抗菌实验，大幅减少了人工操作量和实验误差，缩短了实验周期。本研究中同时完成了4种样品组分、5种致病菌、4个浓度梯度的MIC测定，体现了其显著的高通量优势。
（3）提供细菌生长的动态机制信息：除了最终的MIC值，Bioscreen获得的连续生长曲线还能反映提取物对细菌生长延迟期、对数期和稳定期的影响，有助于深入理解抗菌物质的作用机制。例如，若提取物仅延长细菌的延迟期而不影响对数期生长速率，提示其可能为抑菌剂；若完全抑制细菌生长且无后续增殖，则提示其可能为杀菌剂。
（4）为天然防腐剂的开发提供关键数据支撑：准确的MIC数据是评估天然抗菌剂应用潜力的核心指标，也是后续产品开发中确定添加剂量的重要依据。本研究获得的流出液MIC数据证明其具有作为天然食品防腐剂的开发潜力，为后续的应用研究、配方优化和产品注册提供了关键的技术参数。