Exploring the protective effects of freeze-dried Lactobacillus rhamnosus under optimized cryoprotectants formulation
优化冷冻保护剂配方下鼠李糖乳杆菌冻干保护效应的研究
来源：LWT - Food Science and Technology 173 (2023) 114295
1.论文摘要核心内容
为延长鼠李糖乳杆菌的保存时间并提高其冻干后细胞存活率，本研究以细胞存活率为评价指标，通过响应面实验对冷冻保护剂配方进行优化，最终确定最优组合为11.1%海藻糖、9.1%甘油、3.5%谷氨酸钠和15.7%脱脂奶粉。采用该配方制备的鼠李糖乳杆菌冻干粉在-20℃条件下可稳定保存60天，存活率提升至97.8%，而未添加保护剂的对照组存活率仅为22%。进一步对冻干粉的保护机制研究发现，复合保护剂处理后的细胞细胞膜完整且该完整性可维持至少60天，细胞表面形态光滑并被保护剂完全覆盖，同时细胞关键酶Na⁺/K⁺-ATP酶的活性仅下降4.7%。上述结果表明，复合冷冻保护剂通过增强对细胞膜的保护作用，减少冰晶形成对细胞造成的损伤，从而实现延长保存时间、提高细胞存活率的效果，为鼠李糖乳杆菌的冷冻干燥工艺提供了理论基础。
2.中文关键词（单行）
鼠李糖乳杆菌、冷冻干燥、细胞存活率、响应面法、冷冻保护剂
3.研究目的
核心目的：针对益生菌冷冻干燥过程中细胞存活率低、保存稳定性差的行业共性问题，优化鼠李糖乳杆菌冻干用复合冷冻保护剂配方，显著提升其冻干后存活率与储存稳定性。
机制解析目的：从细胞结构（细胞膜完整性、菌体形态）和细胞功能（关键酶活性）两个层面，系统揭示复合冷冻保护剂对鼠李糖乳杆菌的协同保护机制，阐明其减少冰晶损伤的作用原理。
应用支撑目的：验证优化配方在不同储存温度下的稳定性，为鼠李糖乳杆菌冻干制剂的工业化生产、储存运输及在功能性食品中的应用提供科学依据和技术支撑。
方法学目的：建立基于单因素筛选结合响应面法的益生菌冻干保护剂优化体系，为其他乳酸菌、双歧杆菌等益生菌的冻干保护剂开发提供可复制的研究范式。
4.研究思路
本研究采用“生理状态标准化-单因素初筛-多因素优化-机制验证-稳定性评估”的递进式研究思路，核心流程如下：
第一步，菌体生理状态标准化：使用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定鼠李糖乳杆菌的完整生长曲线，明确其生长周期特征，确定对数末期至稳定前期（16-18小时）为最佳菌体收获期，确保所有冻干实验使用生理状态一致、抗冻性最强的菌体。
第二步，单因素保护剂筛选：选取工业常用的四种冷冻保护剂（海藻糖、甘油、谷氨酸钠、脱脂奶粉），分别考察其在5%-20%浓度范围内对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响，确定各保护剂的最佳单因素作用浓度，为后续响应面实验设定因素水平。
第三步，响应面法优化复合配方：采用Box-Behnken四因素三水平响应面设计，以冻干存活率为响应值，构建二次多项式回归模型，分析各保护剂的主效应及交互作用，通过模型求解获得复合保护剂的最优配比，并进行实验验证。
第四步，保护机制多维度验证：通过荧光染色法检测细胞膜完整性，利用扫描电镜观察细胞微观形态变化，测定Na⁺/K⁺-ATP酶活性评估细胞功能保留情况，从结构和功能两个层面解析复合保护剂的协同保护机制。
第五步，储存稳定性评估：将优化配方制备的冻干粉分别置于-20℃、4℃和25℃条件下储存60天，定期检测活菌数和存活率，明确不同温度对产品稳定性的影响，确定最佳储存条件。
第六步，结果总结与应用展望：综合所有实验数据，总结复合保护剂的优化结果与保护机制，评估其工业化应用潜力，提出后续研究方向。
5.研究亮点
获得了目前同类研究中领先的冻干存活率，优化后的复合保护剂配方使鼠李糖乳杆菌冻干存活率高达97.8%，远高于未添加保护剂的22%，也显著优于多数已报道的单一或复合保护剂配方，大幅提升了益生菌冻干制剂的品质。
系统揭示了复合保护剂的协同保护机制，首次从细胞膜完整性、细胞表面形态、关键膜结合酶活性三个维度，完整阐明了“物理屏障+膜结构稳定+酶活性保护”的三重保护作用原理，为益生菌冻干保护理论提供了新的实验证据。
验证了优化配方的长期储存稳定性，该配方制备的冻干粉在-20℃下储存60天存活率仍保持较高水平，4℃下也能维持较好的稳定性，解决了益生菌冻干粉常温保存易失活的难题，为产品的商业化应用提供了保障。
开发了低成本、易工业化的保护剂配方，所用四种成分均为食品级、价格低廉且易获取的原料，避免了使用昂贵的特殊保护剂，具有良好的工业化生产可行性和经济优势。
实验设计科学严谨，采用响应面法优化多因素交互作用，建立的回归模型拟合度高、预测性强，优化结果经过重复实验验证，数据可靠，为其他益生菌冻干工艺的优化提供了标准化的研究方法。
6.可延伸的方向
冻干工艺参数的协同优化：在现有保护剂配方基础上，进一步优化预冻温度、预冻时间、升华温度、真空度等冻干工艺参数，开展保护剂配方与工艺参数的耦合优化，进一步提高冻干效率和细胞存活率。
体内益生功能保留评估：探究复合保护剂对鼠李糖乳杆菌在模拟胃肠道环境（胃酸、胆盐）中耐受性的影响，以及冻干后菌株的黏附能力、代谢活性和益生功能（如调节肠道菌群、免疫调节）的保留情况，确保产品的实际功效。
新型冷冻保护剂的开发与复配：筛选天然多糖、植物提取物、微生物胞外多糖等新型低成本保护剂，与现有配方进行复配，进一步提升保护效果并降低成本；同时探究纳米包埋技术与冷冻干燥结合的协同保护作用。
不同干燥方式的适配性研究：验证该复合保护剂配方在喷雾干燥、真空微波干燥等其他干燥方式中的适用性，拓展其在不同益生菌制剂生产工艺中的应用范围。
工业化放大与中试研究：在实验室优化结果的基础上，开展100L-1000L规模的中试实验，验证配方在工业化生产中的稳定性、重现性和经济性，解决放大过程中可能出现的问题。
分子层面的保护机制解析：通过转录组学、代谢组学和蛋白质组学技术，分析冻干过程中复合保护剂对鼠李糖乳杆菌基因表达、代谢通路和蛋白质组的影响，从分子水平深入揭示其抗冻保护机制。
产品应用开发：将优化后的冻干粉应用于酸奶、植物基发酵饮料、益生菌片剂、胶囊等不同剂型的产品中，研究其在不同食品基质中的稳定性和感官影响，开发系列功能性益生菌产品。
7.测量的数据、对应图表及研究意义
鼠李糖乳杆菌在30小时培养过程中的OD₆₀₀ₙₘ变化数据，来自Fig 1。研究意义：明确了鼠李糖乳杆菌的生长周期特征，确定16-18小时（对数末期至稳定前期）为最佳菌体收获期，此时细菌细胞密度高、生理状态稳定、抗冻性最强，为后续所有冻干实验提供了标准化的菌体制备依据，从源头避免了因收获期不当导致的存活率波动。
四种单一冷冻保护剂在5%-20%浓度下的冻干存活率数据，来自Fig 2。研究意义：确定了各保护剂的最佳单因素作用浓度（10%海藻糖、10%甘油、5%谷氨酸钠、15%脱脂奶粉），为响应面实验的因素水平设置提供了基础；同时初步比较了不同保护剂的保护效果，发现海藻糖的保护稳定性最优，为复合配方的构建提供了方向。
Box-Behnken响应面实验设计方案及27组实验的冻干存活率结果数据，来自Table 2。研究意义：为构建冻干存活率与四种保护剂浓度之间的二次多项式回归模型提供了原始数据，是分析各因素主效应和交互作用的基础，确保了响应面优化结果的可靠性。
二次多项式回归模型的方差分析数据，来自Table 3。研究意义：验证了所建立的回归模型具有高度统计学显著性（P<0.0001），失拟项不显著（P=0.0640），说明模型能够准确预测不同保护剂组合下的冻干存活率；同时明确了各因素对存活率的影响程度排序为脱脂奶粉>海藻糖>谷氨酸钠>甘油，以及AB、AD、BC、CD等高度显著的交互作用项，为最优配方的求解提供了统计学依据。
响应面模型的拟合优度统计参数数据，来自Table 4。研究意义：R²=0.9875、Adj R²=0.9730、Pred R²=0.9288，表明模型对实验数据的拟合度极高，预测能力强；Adeq Precision=23.035远大于4，说明模型的信噪比良好，进一步证实了优化结果的准确性和可靠性。
四种保护剂两两交互作用对冻干存活率影响的3D响应面图和等高线图，来自Fig 3。研究意义：直观可视化了各因素之间的交互作用强度，曲面越陡峭、等高线越密集表示交互作用越显著，与方差分析结果高度一致；帮助快速定位最优配方的取值范围，使优化过程更加直观高效。
不同处理组（冻干前、无保护剂冻干后、复合保护剂冻干后、-20℃储存60天后）的细胞膜完整性荧光图像数据，来自Fig 4。研究意义：直观证明了无保护剂组细胞在冻干后细胞膜严重破损（大量红色荧光），而复合保护剂组细胞膜在冻干后及长期储存后仍保持完整（以绿色荧光为主），从细胞结构层面直接证实了保护剂的核心作用是维持细胞膜完整性。
不同处理组的细胞微观形态扫描电镜图像数据，来自Fig 5。研究意义：观察到无保护剂组细胞严重变形、皱缩、破裂，胞内物质泄漏；而复合保护剂组细胞表面光滑、形态完整，被一层连续的保护剂膜包裹，复水后细胞形态恢复良好，揭示了保护剂通过形成物理屏障减少冰晶机械损伤的微观机制。
冻干前、无保护剂冻干后、复合保护剂冻干后三组的Na⁺/K⁺-ATP酶活性数据，来自Fig 6。研究意义：定量证明了复合保护剂能有效保护细胞膜关键酶的活性，仅使酶活性下降4.7%，而无保护剂组酶活性下降73.6%；从细胞功能层面阐明了保护剂的作用机制，酶活性的保留是细胞维持正常离子平衡和生理功能的关键。
冻干粉在-20℃、4℃、25℃下储存60天的活菌数和存活率动态变化数据，来自Fig 7。研究意义：系统评估了优化配方的储存稳定性，明确了-20℃为最佳储存温度，4℃可作为短期储存温度，25℃下存活率下降较快；为产品的储存条件设定、保质期确定和冷链运输要求提供了直接的实验依据。
不同文献报道的鼠李糖乳杆菌冻干保护剂配方及存活率对比数据，来自Table 5。研究意义：通过与国内外同类研究的横向对比，突出了本研究优化配方的优越性（存活率97.8%），证明了该配方的先进性和实际应用价值。
8.研究结论
本研究通过单因素实验结合Box-Behnken响应面法，成功优化得到鼠李糖乳杆菌冻干的最佳复合冷冻保护剂配方：11.1%海藻糖、9.1%甘油、3.5%谷氨酸钠和15.7%脱脂奶粉。采用该配方制备的冻干粉冻干存活率高达97.8%，较未添加保护剂的对照组提升了3.4倍，显著优于多数已报道的保护剂配方。
复合冷冻保护剂通过三重协同机制发挥保护作用：一是在细胞表面形成连续的物理屏障，减少冰晶形成对细胞的机械损伤；二是稳定细胞膜的液晶态结构，维持细胞膜的完整性；三是保护细胞膜结合酶Na⁺/K⁺-ATP酶的活性，确保细胞正常的离子平衡和生理功能。
优化配方制备的鼠李糖乳杆菌冻干粉具有良好的储存稳定性，在-20℃下储存60天存活率仍保持较高水平，4℃下储存60天存活率为76.7%，25℃下储存稳定性较差，建议产品在低温条件下储存和运输。
本研究开发的复合保护剂配方所用原料均为食品级、低成本、易获取的物质，具有良好的工业化生产可行性；制备的冻干粉可广泛应用于酸奶、植物发酵饮料、直接口服益生菌粉等功能性食品中，具有广阔的市场应用前景。
本研究建立的益生菌冻干保护剂优化体系和多维度机制解析方法，可为其他乳酸菌、双歧杆菌等益生菌的冷冻干燥工艺开发提供重要的参考和借鉴。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义详细解读
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪测定鼠李糖乳杆菌的生长曲线，是整个研究的基础和前提，其测量数据的研究意义贯穿于实验设计、过程控制和结果可靠性的全流程，具体体现在以下六个核心层面：
第一，精准确定最佳菌体收获期，从源头保障冻干实验的成功率和重复性。
冷冻干燥过程对细菌的生理状态极为敏感，不同生长阶段的细菌在细胞膜组成、胞内物质含量、抗逆性等方面存在显著差异。对数期细菌代谢活跃但细胞膜流动性高、抗冻性差，衰亡期细菌活力下降、胞内酶活性降低，而对数末期至稳定前期的细菌细胞密度最高、细胞膜结构最稳定、胞内积累的抗逆物质（如海藻糖、脯氨酸）最多，是冻干的最佳时期。Bioscreen C仪器通过每2小时一次的全自动OD₆₀₀ₙₘ检测，连续监测30小时，获得了鼠李糖乳杆菌完整的、高时间分辨率的生长曲线，精准捕捉了延迟期（0-4小时）、对数生长期（4-18小时）和稳定期（18小时后）的起止时间。基于该数据，研究团队确定16-18小时为最佳收获期，这一精准的时间点选择避免了因收获过早或过晚导致的冻干存活率大幅波动，确保了所有批次实验使用的菌体生理状态完全一致，为后续单因素实验、响应面实验和机制验证实验提供了标准化的实验材料，从根本上保证了实验结果的重复性和可靠性。
第二，提供定量化的生长动力学参数，实现实验条件的精准控制。
传统的人工取样法测定生长曲线不仅操作繁琐、劳动强度大，而且时间间隔通常为4-6小时，无法准确捕捉细菌生长的关键拐点，容易导致收获期判断误差。Bioscreen C仪器的全自动检测系统能够在恒温、恒振荡的标准化条件下，对100个样本同时进行连续监测，获得的生长曲线数据平滑、无噪声。通过对生长曲线的分析，可以精准计算出最大比生长速率、延迟期时长、最大生物量等关键生长动力学参数。这些参数不仅用于确定最佳收获期，还为种子液的接种量、培养时间等实验条件的设定提供了定量化依据。本研究中根据生长曲线确定的5%接种量和16-18小时培养时间，能够稳定获得OD₆₀₀ₙₘ约为1.5的菌液，细胞浓度约为10⁹ CFU/mL，完全满足冻干实验的菌体量需求，同时避免了过度培养导致的代谢废物积累和细菌活力下降。
第三，验证实验菌株的活力和纯度，排除实验系统误差。
微生物实验中，菌株的活力和纯度是影响实验结果的关键因素。如果菌株发生退化、污染或活力下降，其生长曲线会出现异常，如延迟期延长、对数期生长缓慢、稳定期OD值偏低等。Bioscreen C仪器获得的生长曲线能够直观反映菌株的生长特性。本研究中鼠李糖乳杆菌的生长曲线呈现典型的S型，延迟期短、对数期生长迅速、稳定期OD值稳定，说明菌株活力良好、纯度高，未发生退化或污染。这一验证步骤排除了因菌株问题导致的实验失败风险，确保了后续所有实验数据的有效性。如果生长曲线出现异常，研究团队可以及时重新活化菌株或更换菌种，避免了人力、物力和时间的浪费。
第四，为不同保护剂的效果比较提供统一的基准。
在单因素实验和响应面实验中，不同保护剂组合对冻干存活率的影响需要在相同的菌体初始状态下进行比较才有意义。如果不同批次的菌体生长状态不同，即使保护剂配方相同，冻干存活率也可能出现显著差异，导致无法准确判断保护剂的真实效果。Bioscreen C仪器提供的标准化生长曲线和收获期，确保了每一批次用于冻干的菌体都处于相同的生理状态，消除了菌体生长状态差异带来的系统误差。这使得不同保护剂之间的效果比较更加客观、准确，能够真实反映保护剂配方对冻干存活率的影响，为最优配方的筛选提供了可靠的基础。
第五，为益生菌冻干工艺的工业化放大提供基础数据。
实验室规模的冻干实验结果要转化为工业化生产，需要准确的菌体培养工艺参数。Bioscreen C仪器测定的生长动力学参数，如比生长速率、倍增时间、最佳收获期等，可以直接用于指导工业发酵罐的放大生产。通过将实验室获得的生长参数与工业发酵罐的溶氧、搅拌、温度等参数相结合，可以制定出标准化的工业发酵工艺，确保在大规模生产中也能获得与实验室一致的、处于最佳生理状态的菌体，从而保证工业化冻干产品的存活率和稳定性。
第六，为其他益生菌的冻干研究提供可推广的方法学参考。
Bioscreen C仪器在微生物生长曲线测定中的应用，实现了生长动力学研究的高通量、自动化和标准化。本研究中利用该仪器确定最佳菌体收获期的方法，具有普适性，可以推广应用于其他乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌等益生菌的冻干研究。不同益生菌的生长特性不同，最佳收获期也存在差异，通过Bioscreen C仪器可以快速、准确地测定各种益生菌的生长曲线，确定其各自的最佳培养条件和收获时间，大幅提高益生菌冻干工艺的研究效率和实验结果的可靠性。