Cytochrome bd-Dependent Bioenergetics and Antinitrosative Defenses in Salmonella Pathogenesis
细胞色素bd依赖的生物能量学与抗亚硝化防御在沙门氏菌致病中的作用
来源：Salmonella pathogenesis.mBio 7(6):e02052-16 2016
1. 摘要
感染过程中，肠炎沙门氏菌会定植于氧（O₂）和一氧化氮（NO）浓度各异的解剖部位，这两种气体竞争结合醌氧化酶的催化金属基团。肠杆菌科表达两类进化上不同的醌氧化酶，它们对O₂和NO的亲和力以及跨膜转运质子的化学计量比存在显著差异。本研究表明，细菌细胞色素bd在生物能量学和抗亚硝化防御中的双重功能显著增强了沙门氏菌的毒力：其对O₂的高亲和力优化了低氧环境下的呼吸速率，使细菌在氧限制条件下的生长最大化；同时，细胞色素bd（而非细胞色素bo）是沙门氏菌适应性抗亚硝化工具箱的固有组成部分，能帮助细菌在抑制性NO存在下维持生长和呼吸。细胞色素bd与黄素血红蛋白Hmp的联合抗亚硝化防御，在很大程度上帮助沙门氏菌从NO的抗菌活性中恢复，且两者协同作用促进了沙门氏菌在全身组织中的定植与生长。综上，细胞色素bd是沙门氏菌抵抗哺乳动物宿主先天免疫产生的亚硝化应激、同时在组织缺氧环境中正常利用氧的关键机制。
2. 关键词（中文）
细胞色素bd、生物能量学、抗亚硝化防御、沙门氏菌致病、一氧化氮、醌氧化酶、黄素血红蛋白Hmp、组织缺氧
3. 研究目的
明确细胞色素bd在沙门氏菌感染过程中的双重核心功能——缺氧环境下的生物能量支持和抗亚硝化防御；比较细胞色素bd与细胞色素bo在抵抗NO毒性中的作用差异；探究细胞色素bd与已知主要抗亚硝化因子黄素血红蛋白Hmp之间的独立与协同关系；通过体内外实验验证两者在沙门氏菌全身致病中的协同作用，揭示沙门氏菌适应宿主缺氧和免疫压力的分子机制，为开发靶向细菌呼吸链的新型抗菌药物提供潜在靶点。
4. 研究思路
首先构建沙门氏菌cyoABCD（编码细胞色素bo）和cydAB（编码细胞色素bd）基因敲除菌株，通过小鼠口服感染模型评估两种醌氧化酶对胃肠道定植和肠道炎症的影响。
利用Bioscreen C生长分析仪和氧电极呼吸测定系统，比较野生型、cyoABCD和cydAB突变株在NO供体处理下的生长动力学和呼吸能力，初步明确细胞色素bd的抗亚硝化作用。
进一步构建hmp单突变和hmp cydAB双突变菌株，通过生长曲线、呼吸速率测定和实时荧光定量PCR，从表型、生化和转录水平探究细胞色素bd与Hmp在抗亚硝化防御中的功能分工与协同效应。
最后通过小鼠腹腔感染的竞争实验和生存实验，结合诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抑制剂处理，验证细胞色素bd和Hmp在体内全身感染中的协同致病作用，并结合生化数据提出细胞色素bd解毒NO的双途径分子机制模型。
5. 研究亮点
（1）双重功能系统揭示：首次在体内外系统证明细胞色素bd同时承担“缺氧呼吸支持”和“抗亚硝化防御”两大核心功能，解释了沙门氏菌在宿主复杂微环境中的生存优势。
（2）功能分化明确：清晰区分了两类醌氧化酶的功能差异——细胞色素bo主要负责高氧环境下的高效产能，而细胞色素bd是沙门氏菌应对低氧和亚硝化应激的关键因子。
（3）协同机制验证：发现细胞色素bd与黄素血红蛋白Hmp在抗亚硝化防御中功能独立且协同，两者在体内全身感染中对沙门氏菌毒力的贡献相当，双突变株的毒力下降超过两个数量级。
（4）分子机制创新：提出细胞色素bd通过“亚硝酰途径”（高NO/O₂比、高电子流）和“亚硝酸盐途径”（低NO/O₂比、低电子流）两种模式解毒NO的分子机制，解释了其在不同宿主微环境中的适应性。
（5）临床转化价值：明确了细胞色素bd作为新型抗菌药物靶点的潜力，其缺失会同时削弱细菌的能量代谢和抗宿主免疫能力，且该靶点在多种致病菌中保守存在。
6. 可延伸的研究方向
（1）功能拓展研究：探究细胞色素bd-II（由cyxAB编码）在沙门氏菌生物能量学和抗亚硝化防御中的作用，明确三类醌氧化酶的精细功能分工与协同调控网络。
（2）感染场景深化：研究细胞色素bd在沙门氏菌生物膜形成、巨噬细胞内生存和慢性感染中的作用，这些场景通常同时存在低氧和高NO浓度的双重压力。
（3）药物开发应用：开发靶向细胞色素bd的特异性小分子抑制剂，评估其单独或与现有抗生素联合使用的抗菌效果，尤其是针对多重耐药沙门氏菌菌株。
（4）普适性验证：将研究拓展至结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、志贺菌等其他重要致病菌，验证细胞色素bd抗亚硝化和致病功能的普遍性。
（5）宿主-病原体互作：探究宿主免疫反应中O₂和NO浓度的动态变化对沙门氏菌醌氧化酶表达的时空调控，揭示病原体感知和适应宿主环境的新机制。
（6）安全性评估：研究细胞色素bd抑制剂对肠道共生菌群的影响，优化药物的选择性，降低对正常菌群的干扰。
7. 测量的数据及研究意义
（1）小鼠口服感染后的粪便排菌量和肠道组织（回肠、盲肠、结肠）载菌量数据，来自图1A和1B。该数据表明细胞色素bo和细胞色素bd对沙门氏菌在胃肠道的定植影响较小，仅cydAB突变株在结肠的载菌量略有降低，说明细胞色素bd在肠道定植中作用有限，为后续聚焦全身感染研究提供了依据。
（2）小鼠盲肠组织的组织病理学评分数据，包括黏膜下水肿、中性粒细胞浸润和杯状细胞缺失程度，来自图1C和1D。该数据显示各菌株诱导的肠道炎症水平相似，进一步验证了醌氧化酶缺失不显著影响沙门氏菌的肠道致病能力。
（3）野生型、cyoABCD和cydAB突变株在DETA对照和5 mM DETA NONOate（NO供体）处理下的生长曲线数据，来自图2A。该数据通过Bioscreen C测定，证明细胞色素bd缺失会导致细菌在正常LB培养基中生长减慢，且对NO的敏感性显著升高，而细胞色素bo缺失无此效应，从表型水平明确了细胞色素bd的抗亚硝化作用。
（4）野生型和cydAB突变株细胞质膜的紫外-可见吸收光谱数据，来自图2B。该数据显示cydAB突变株缺失了650 nm处的血红素d特征吸收峰，从生化水平直接验证了cydAB基因敲除成功，细胞色素bd表达完全缺失。
（5）50 μM精胺NONOate处理前后野生型、cyoABCD和cydAB突变株的实时呼吸速率数据，来自图2C。该数据表明cydAB突变株的基础呼吸速率更低，且对NO的抑制作用更敏感，无法在短时间内恢复呼吸，证明细胞色素bd能直接保护呼吸链免受NO的毒性损伤。
（6）野生型、hmp、cydAB和hmp cydAB突变株的全细胞差示光谱数据，来自图3A。该数据显示hmp突变株的细胞色素bd表达量显著高于野生型，提示沙门氏菌在Hmp缺失时会上调细胞色素bd的表达以代偿抗亚硝化防御功能。
（7）野生型、hmp、cydAB和hmp cydAB突变株在1 mM DETA对照和1 mM DETA NONOate处理下的生长曲线数据，来自图3B。该数据表明hmp和cydAB单突变株对NO的敏感性均高于野生型，而双突变株的生长抑制最为显著，证明两者在抗亚硝化防御中具有独立且叠加的作用。
（8）50 μM精胺NONOate处理后不同时间点野生型和hmp突变株中cydA基因的转录水平数据，来自图3C。该数据显示NO能快速且显著诱导cydA的表达，且hmp突变株中cydA的基础表达量更高，从转录水平验证了细胞色素bd是沙门氏菌适应性抗亚硝化反应的核心组成部分。
（9）50 μM精胺NONOate处理1分钟和10分钟后野生型、cydAB、hmp和hmp cydAB突变株的呼吸速率数据，来自图3D。该数据表明Hmp在快速解毒NO中起主要作用，而细胞色素bd在后期呼吸恢复中起关键作用，双突变株几乎无法恢复呼吸，进一步证明了两者的协同效应。
（10）小鼠腹腔混合感染后的肝脏竞争指数数据，来自图4A。该数据显示hmp和cydAB单突变株的竞争指数均约为0.1，毒力下降程度相当，而双突变株的竞争指数降至0.01，毒力显著降低，证明两者在体内全身感染中具有协同致病作用。
（11）小鼠腹腔感染后的生存曲线数据，来自图4B。该数据显示hmp cydAB双突变株的毒力显著弱于野生型和单突变株，而iNOS抑制剂氨基胍处理能部分恢复双突变株的毒力，直接证明细胞色素bd和Hmp的抗亚硝化防御是沙门氏菌全身致病的关键机制。
8. 结论
本研究系统证明了细胞色素bd在沙门氏菌致病中发挥不可替代的双重核心作用：一方面，其对O₂的高亲和力使沙门氏菌能够在宿主组织缺氧环境中维持高效的呼吸和能量代谢，支持细菌在全身组织中的生长；另一方面，细胞色素bd是沙门氏菌关键的抗亚硝化防御因子，既能通过优先结合NO保护细胞色素bo的呼吸功能，又能通过亚硝酰途径和亚硝酸盐途径直接解毒NO。
细胞色素bd与已知的主要抗亚硝化因子黄素血红蛋白Hmp在功能上独立且协同，两者共同构成了沙门氏菌应对宿主先天免疫产生的亚硝化应激的核心防御体系，在全身感染中对沙门氏菌的毒力具有同等重要的贡献。本研究揭示了沙门氏菌适应宿主复杂微环境的新机制，为开发靶向细菌呼吸链的新型抗菌药物提供了重要的理论基础和极具潜力的药物靶点。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C微生物生长曲线分析仪，测定了野生型、cyoABCD、cydAB、hmp及hmp cydAB突变株在有无NO供体处理下的生长动力学，相关数据来自图2A和图3B。实验中，将过夜培养的沙门氏菌按1:500稀释至新鲜LB培养基，每个条件设置10个技术重复，在37℃连续振荡条件下培养，每15分钟自动测定一次OD₆₀₀值，连续监测30小时。该仪器在此研究中的应用及数据的研究意义主要体现在以下六个方面：
（1）高通量平行测定，高效比较多菌株表型：Bioscreen C支持100孔板同时检测，本研究一次性完成了5株菌株、2种处理条件的生长曲线测定，每个条件10个生物学重复，大幅减少了人工操作的工作量和批次间差异，确保了不同菌株、不同处理组之间结果的可比性，显著提高了实验效率。
（2）精确量化生长动力学参数，直观揭示基因功能：通过连续高密度监测OD₆₀₀的动态变化，可精确计算出各菌株的延迟期、最大比生长速率和最大生物量等关键参数。例如，图2A的数据清晰显示cydAB突变株在无NO的LB培养基中生长减慢、延迟期延长，直观揭示了细胞色素bd在正常氧浓度下对细菌基础生长的重要性；而在NO供体处理后，cydAB突变株的生长抑制进一步加剧，延迟期延长超过10小时，直接证明了其抗亚硝化功能。
（3）标准化实验条件，保证结果可靠性：Bioscreen系统能够精确控制培养温度（37℃）、振荡频率和模式，消除了人工培养过程中环境因素波动对细菌生长的影响。所有菌株和处理组均在完全相同的标准化条件下培养，确保了实验结果的可重复性，为后续的生化和分子机制研究提供了坚实的表型基础。
（4）动态捕捉生长过程，发现精细表型差异：每15分钟一次的高密度数据采集，能够完整记录细菌从延迟期、对数期到稳定期的整个生长过程，捕捉到传统人工取样无法观察到的瞬时表型变化。例如，图3B的数据显示hmp cydAB双突变株在NO处理后几乎完全停止生长，延迟期超过20小时，而单突变株仅表现为部分生长抑制，这种精细的生长动力学差异为证明两者的协同作用提供了最直接的表型证据。
（5）多维度验证实验结果，形成完整证据链：Bioscreen测得的生长表型数据与后续的呼吸速率测定、转录组分析和动物实验结果相互印证。例如，呼吸速率实验显示cydAB突变株的基础呼吸速率降低，而生长曲线数据则直接反映了这种呼吸缺陷对细菌生长的影响；转录组数据显示NO诱导cydA表达，而生长曲线数据则证明了这种诱导表达的功能意义——帮助细菌在亚硝化应激下恢复生长。
（6）为抗菌药物筛选提供高通量平台：本研究建立的基于Bioscreen的NO敏感性测定方法，可快速筛选靶向细胞色素bd或Hmp的抗菌化合物。通过监测化合物处理后细菌在NO压力下的生长曲线，能够高效评估化合物的抗菌活性和作用机制，为新型抗沙门氏菌药物的研发提供了高通量、自动化的筛选平台。