Insight into the spoilage heterogeneity of meat-borne bacteria isolates with high-producing collagenase
高产胶原酶的肉源细菌分离株腐败异质性研究
来源：H.D. Wang et al. / Food Science and Human Wellness 13 (2024) 1402-1409
1. 摘要
冷鲜鸡在屠宰和加工过程中不可避免地会受到微生物污染，进而导致腐败。冷鲜鸡的分割部位，尤其是鸡翅、鸡爪等带皮产品，富含胶原蛋白，可能是腐败微生物降解的主要靶点。本研究通过生鸡肉汁琼脂（RJA）法，从17株可同时分泌胶原酶和脂肪酶的腐败细菌分离株中，筛选出7株能显著分解胶原蛋白的菌株，分属于沙雷氏菌属、气单胞菌属和假单胞菌属。明胶酶谱分析显示，液化沙雷氏菌（F5）和嗜皂假单胞菌（G7）在约50 kDa处有明显降解条带，维氏气单胞菌（G8）和杀鲑气单胞菌（H8）分别在约65 kDa和95 kDa处有降解条带。对各菌株的脂肪酶和胶原酶活性进行逐株检测，发现F5的胶原酶活性最高。原位肉品腐败能力实验表明，从菌落总数、总挥发性盐基氮含量、感官评分、脂肪酶及胶原酶活性等指标来看，F5的腐败能力最强。本研究为肉品中高产胶原酶菌株的腐败异质性提供了理论依据。
2. 关键词（中文）
细菌、冷鲜鸡、异质性、胶原酶、腐败
3. 研究目的
从富含胶原蛋白的冷鲜鸡部位筛选高产胶原酶的腐败细菌分离株，系统阐明其酶学特性、生长动力学特征及实际腐败潜力，深入揭示冷鲜鸡中胶原蛋白降解相关的腐败过程，为冷鲜鸡的精准保鲜和货架期延长提供科学理论基础。
4. 研究思路
首先从腐败冷鲜鸡爪中分离获得17株同时产胶原酶和脂肪酶的菌株；采用生鸡肉汁琼脂（RJA）平板法评估菌株的体外基质分解能力，筛选出能形成明显分解圈的7株目标菌株，并通过16S rDNA测序进行菌种鉴定；选取4株代表性菌株（F5、H8、G7、G8），通过明胶酶谱分析其胶原酶的分子量特征，同时定量测定体外胶原酶和脂肪酶活性；利用芬兰Bioscreen自动生长曲线分析仪，测定4株菌在10℃（冷鲜鸡实际贮藏温度）和30℃（常温）下的生长曲线，并用Logistic、Gompertz和Hill三种方程拟合生长数据，确定最优动力学模型；最后将4株菌接种至辐照灭菌的无骨鸡爪中，在10℃下贮藏7天，通过定期测定菌落总数、总挥发性盐基氮（TVB-N）含量、感官评分及原位酶活性，综合评估其实际腐败能力；结合统计学分析，明确不同高产胶原酶菌株的腐败异质性及其关键影响因素。
5. 研究亮点
（1）研究视角创新：突破了以往肉品腐败研究多聚焦于肌原纤维蛋白降解的局限，首次系统关注胶原蛋白降解途径，明确了高产胶原酶菌株在冷鲜鸡（尤其是富含胶原蛋白的部位）腐败中的核心作用。
（2）研究体系完整：整合了体外筛选、酶学特性分析、生长动力学建模和原位腐败验证四个维度，全面解析了高产胶原酶菌株的腐败异质性，结果更贴近实际生产场景。
（3）温度针对性强：同时测定了菌株在冷藏温度（10℃）和常温（30℃）下的生长特性，精准反映了冷鲜鸡在不同流通环节中的腐败菌生长规律，为分阶段防控提供了依据。
（4）明确了关键靶标菌株：鉴定出液化沙雷氏菌（F5）为高产胶原酶的强腐败菌，其胶原酶活性和原位腐败能力均显著高于其他菌株，为冷鲜鸡靶向防腐技术的研发提供了明确的微生物靶点。
6. 可延伸的研究方向
（1）分子机制层面：解析高产胶原酶菌株（如F5）中胶原酶基因的表达调控网络，鉴定关键调控因子和信号通路，揭示其在肉品基质中高效分泌胶原酶的分子机制。
（2）保鲜技术层面：评估天然防腐剂、气调包装、超高压处理等不同保鲜技术对高产胶原酶腐败菌的抑制效果，开发针对胶原酶降解途径的靶向保鲜策略。
（3）群落生态层面：研究冷鲜鸡不同部位（翅、爪、皮、胸肉）中高产胶原酶菌的群落组成和贮藏期间的演替规律，明确不同部位的腐败特征差异。
（4）协同作用层面：探究多种高产胶原酶菌株之间，以及高产胶原酶菌与其他常见肉品腐败菌（如乳酸菌、希瓦氏菌）之间的协同/拮抗腐败作用，揭示混合菌群的腐败机制。
（5）检测技术层面：建立基于胶原酶活性或特异性基因的冷鲜鸡腐败快速检测方法，实现腐败的早期预警和货架期的快速预判。
7. 测量的数据及研究意义
（1）生鸡肉汁琼脂（RJA）平板的菌落直径（BCDs）和分解圈直径（DZDs）数据，来自图1。该数据直观量化了菌株利用鸡肉天然基质的能力，是初步筛选高产胶原酶腐败菌的核心依据，成功从17株初筛菌株中筛选出7株具有显著胶原蛋白分解能力的目标菌株。
（2）菌株16S rDNA鉴定结果，来自表1。明确了7株目标菌株的分类学地位，分别为液化沙雷氏菌（F5）、杀鲑气单胞菌（H8）、3株嗜皂假单胞菌（G3、G4、G7）、1株假单胞菌属（G6）和维氏气单胞菌（G8），为后续所有实验提供了准确的菌种基础。
（3）明胶酶谱的胶原酶降解条带数据，来自图2。揭示了不同菌株分泌的胶原酶在分子量上的显著差异，反映了胶原酶的分子多样性，为后续酶的分离纯化和结构功能研究提供了初步依据。
（4）体外胶原酶和脂肪酶活性定量数据，来自图3A和图3B。通过统计学比较发现，4株代表性菌株的脂肪酶活性无显著差异，但F5的胶原酶活性显著高于其他菌株，直接证明了胶原酶活性差异是导致菌株腐败异质性的关键因素。
（5）10℃和30℃下的细菌生长曲线数据及三种模型的拟合参数，来自图4、表S1和表S2。系统揭示了不同菌株的温度适应性和生长动力学特征，确定Logistic模型为描述这4株菌生长的最优模型，获得的最大比生长速率、延迟期等关键参数可用于预测腐败菌在不同温度下的生长趋势。
（5）原位贮藏期间的菌落总数动态数据，来自图5A和图6。反映了菌株在真实鸡肉基质中的生长繁殖能力，发现F5的生长速率最快，第3天菌落总数即超过国家标准（GB 2749–2015）规定的6 lg (CFU/g)限值，与体外生长特性一致。
（7）原位贮藏期间的总挥发性盐基氮（TVB-N）含量数据，来自图5B。定量评估了菌株分解蛋白质产生挥发性含氮物质的能力，F5和H8组的TVB-N含量显著高于G7和G8组，直接反映了菌株的蛋白质分解能力和腐败程度。
（8）原位贮藏期间的感官评分数据，来自图7。从消费者可接受度的角度评估了肉品的腐败进程，结果显示F5、H8和G8组在第3天感官评分即降至6分以下（不可接受），与菌落总数和TVB-N数据高度一致，验证了微生物和理化指标的可靠性。
（9）原位贮藏期间的脂肪酶和胶原酶活性动态数据，来自图8A和图8B。证实了菌株在鸡肉基质中能持续分泌胞外酶，且F5的胶原酶活性在整个贮藏期间始终显著高于其他菌株，进一步建立了胶原酶活性与腐败能力之间的正相关关系。
8. 结论
本研究从腐败冷鲜鸡爪中筛选出7株能在生鸡肉汁琼脂平板上形成明显分解圈的高产胶原酶菌株，分属于沙雷氏菌属、假单胞菌属和气单胞菌属，其中液化沙雷氏菌（F5）和杀鲑气单胞菌（H8）的体外基质分解能力最强。各菌株的脂肪酶活性无显著差异，但F5的胶原酶活性显著高于其他菌株。明胶酶谱分析显示，不同菌株分泌的胶原酶分子量存在明显差异，F5和假单胞菌菌株的胶原酶约为50 kDa，G8和H8分别约为65 kDa和95 kDa。原位腐败实验表明，F5的综合腐败能力最强，其接种的冷鲜鸡爪在10℃贮藏第3天即达到腐败阈值，且原位胶原酶和脂肪酶活性最高。研究结果提示，冷鲜鸡中高产胶原酶的腐败细菌应引起高度重视，其分泌的胶原酶是导致富含胶原蛋白部位腐败的关键因素。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen FP-1100-C自动生长曲线分析仪，测定了4株代表性高产胶原酶菌株（F5、H8、G7、G8）在10℃和30℃下的生长曲线，数据来自图4。该仪器在此研究中的应用及数据的研究意义主要体现在以下五个方面：
（1）精准反映菌株的温度适应性与生长特性：通过连续监测48小时（30℃）和168小时（10℃）的OD₆₀₀值，获得了完整的细菌生长曲线，明确了不同菌株在冷鲜鸡实际贮藏温度（10℃）和常温（30℃）下的生长差异。结果显示F5和H8在10℃下生长更快且最终生物量更高，证明这两株菌是冷鲜鸡冷藏过程中的主要优势腐败菌，为靶向防控提供了明确对象。
（2）建立可靠的定量生长动力学模型：基于Bioscreen获得的高密度连续数据，分别用Logistic、Gompertz和Hill三种经典模型进行拟合，通过比较相关系数R²，确定Logistic模型为描述这4株菌生长的最优模型。拟合得到的最大OD值、达到最大生长速率的时间、最大比生长速率等关键参数，可用于预测不同温度下腐败菌的生长趋势，为冷鲜鸡货架期的精准预测和保鲜工艺的优化提供了数学基础。
（3）解释腐败异质性的生长基础：生长曲线数据显示，即使同为高产胶原酶菌株，其生长动力学特征也存在显著差异。例如30℃下G8生长最快，G7最慢；10℃下H8生长速率最快，而F5的最终生物量最高。这种生长特性的差异是导致菌株腐败异质性的重要原因之一，结合酶活性数据可更全面地解析“生长-产酶-腐败”的内在联系。
（4）提升实验效率与数据可靠性：Bioscreen仪器支持96孔板高通量同步检测，可自动连续读取吸光度值，避免了人工取样带来的操作误差和时间偏差，同时大幅减少了实验工作量。获得的生长曲线数据连续、平滑、重复性好，为后续的模型拟合和统计学分析提供了高质量的基础数据。
（5）为保鲜技术的快速筛选提供平台：该生长曲线测定方法可作为一种高效的体外筛选模型，用于快速评估不同保鲜剂、包装方式、加工工艺等对高产胶原酶腐败菌生长的抑制效果。通过对比处理组和对照组的生长动力学参数，可量化保鲜技术的作用强度，显著缩短新型保鲜技术的研发周期。