Integration of metabolic and bioprocess engineering for the production of β-ketoadipic acid from glucose and xylose by Pseudomonas putida
代谢与生物过程工程整合用于恶臭假单胞菌利用葡萄糖和木糖生产β-酮己二酸
来源：Green Chem., 2025, 27,10673
1. 摘要
β-酮己二酸是微生物有氧芳香族化合物分解代谢的常见中间体，可作为高性能生物基聚合物的单体。本研究对恶臭假单胞菌KT2440进行代谢工程改造，使其能够利用木质纤维素多糖水解产生的两种主要糖类——葡萄糖和木糖生产β-酮己二酸。以最优菌株GR038为研究对象，采用模拟木质纤维素水解液的2:1摩尔比葡萄糖-木糖混合底物开展生物过程开发，补料分批发酵实现了65.8 g/L的产物滴度、0.69 g/(L·h)的生产速率和0.52 C-mol的碳收率。进一步引入吸附式原位产物回收（ISPR）技术后，有效滴度提升至92.0 g/L，生产速率提高到0.83 g/(L·h)，同时下游β-酮己二酸的纯度从88.3 wt%提升至99.0 wt%。这些结果为利用木质纤维素糖类工业化生产β-酮己二酸展现了良好前景。
2. 关键词（中文）
β-酮己二酸、恶臭假单胞菌、代谢工程、生物过程工程、葡萄糖木糖共利用、原位产物回收、木质纤维素生物炼制
3. 研究目的
构建能够高效共利用葡萄糖和木糖的β-酮己二酸生产菌株，解决单一糖源利用导致的木质纤维素原料利用率低的问题；通过生物过程优化和原位产物回收技术，突破产物抑制瓶颈，大幅提升β-酮己二酸的滴度、产率和纯度；建立从菌株改造到发酵生产再到产物分离的全流程技术体系，为该生物基单体的工业化生产提供可行方案和理论支撑。
4. 研究思路
以已构建的能共利用葡萄糖和木糖的粘康酸生产菌株LC224为出发底盘，通过多轮理性代谢工程改造：恢复原儿茶酸3,4-双加氧酶基因pcaHG和粘康酸代谢基因簇catRBCA，删除导致碳流分流的aroY/ecdB基因，敲除β-酮己二酸分解代谢关键基因pcaIJ以实现产物积累，进一步删除levulinic acid代谢基因lvaE和全局调控基因gacS，并调控葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi的表达以优化碳流分配，最终获得高产菌株GR038。
依次在摇瓶、0.5 L分批生物反应器和10 L补料分批生物反应器中评估菌株生产性能，优化发酵工艺参数；筛选并验证对β-酮己二酸具有高吸附容量的阴离子交换树脂，建立双柱交替吸附-解吸的原位产物回收系统，与3 L生物反应器耦合运行；对比有无ISPR的发酵过程参数和产物纯度，验证工艺优势；最后通过热力学计算分析β-酮己二酸途径与粘康酸途径的能量差异，解释前者生产性能更优的内在机制。
5. 研究亮点
（1）原料适配性突破：首次实现了恶臭假单胞菌同时利用葡萄糖和木糖高效生产β-酮己二酸，底物组成模拟真实木质纤维素水解液，显著提升了可再生原料的利用率。
（2）生产性能大幅提升：通过整合代谢工程与生物过程优化，将β-酮己二酸的补料分批发酵滴度从之前报道的26.0 g/L提升至65.8 g/L，生产速率提高近10倍，碳收率达到0.52 C-mol。
（3）原位产物回收创新应用：首次将吸附式ISPR技术应用于β-酮己二酸生产，有效缓解了产物抑制，使有效滴度进一步提升至92.0 g/L，同时将产物纯度从88.3 wt%提高到99.0 wt%，省去了活性炭脱色步骤，简化了下游纯化工艺。
（4）连续稳定的分离系统：开发了双柱交替运行的吸附工艺，实现了不间断的产物回收和稳定的发酵体系pH控制，解决了传统间歇吸附导致的工艺波动问题，为工业化放大奠定了基础。
（5）机制解析深入：通过热力学定量分析，揭示了β-酮己二酸途径比粘康酸途径具有更有利的自由能变化（-372 kJ/mol vs -323 kJ/mol），从能量角度解释了其生产性能更优的分子机制。
6. 可延伸的研究方向
（1）菌株进一步工程化：强化莽草酸途径的碳通量，优化辅酶（如NADPH）供应，敲除潜在的副产物生成途径，进一步提高碳收率和产物特异性；开发对木质纤维素水解液中抑制物（如酚类、呋喃类）具有耐受性的工程菌株。
（2）原位产物回收系统优化：开发对β-酮己二酸具有更高选择性和吸附容量的新型树脂；优化柱操作参数（如流速、循环时间），提高产物回收率，降低洗脱剂（NaOH）的消耗；实现洗脱剂的循环利用，减少废水排放。
（3）真实木质纤维素原料利用：直接以玉米秸秆、甘蔗渣等农林废弃物的水解液为底物进行发酵，评估水解液中复杂成分对菌株生长和生产的影响，建立适配真实原料的发酵工艺。
（4）下游工艺整合与放大：将ISPR吸附洗脱过程与后续的酸化、萃取、结晶步骤耦合，开发连续化的下游纯化工艺；开展中试规模的发酵-分离一体化实验，验证工艺的稳定性和经济性。
（5）技术经济与环境评估：开展全生命周期评价（LCA）和技术经济分析（TEA），量化该工艺的碳排放、水耗和生产成本，识别关键成本瓶颈，指导工艺的进一步优化。
（6）产物应用拓展：合成β-酮己二酸基尼龙等高性能聚合物，评估其机械性能、热稳定性和生物降解性，拓展其在纺织、汽车、电子等领域的应用。
7. 测量的数据及研究意义
（1）不同基因改造菌株的生长曲线数据，来自图S1。该数据通过Bioscreen C Pro高通量测定，直观展示了各基因操作对菌株生长表型的影响，如pcaIJ基因删除导致延迟期延长约12小时，pgi-1基因的恢复可改善混合糖利用时的生长性能，为菌株构建过程中的表型筛选和代谢通路合理性验证提供了依据。
（2）摇瓶发酵过程数据，包括OD₆₀₀、葡萄糖/木糖浓度和β-酮己二酸滴度，来自图2A和2B。该数据对比了GR020和GR038菌株在摇瓶水平的生产性能，证明两者摇瓶产量相近，但GR038的生长延迟期更短，为后续生物反应器实验的菌株选择提供了基础。
（3）0.5 L分批生物反应器发酵数据，来自图2C和2D。该数据验证了GR038在放大条件下的生产优势，其滴度（17.5 g/L）、产率（0.37 g/(L·h)）和碳收率（0.41 C-mol）均优于GR020，确认了GR038作为最优生产菌株的地位。
（4）10 L补料分批生物反应器发酵数据，来自图3B。该数据展示了GR038在优化的补料策略下的最高生产性能，获得了65.8 g/L的滴度、0.69 g/(L·h)的产率和0.52 C-mol的碳收率，是当时文献报道的最高水平，证明了该工艺的放大潜力。
（5）三种阴离子交换树脂的β-酮己二酸吸附容量数据，来自表2和图S4。该数据筛选出Amberlite IRA-910树脂具有最高的吸附容量（0.92 g/mL床体积），为ISPR系统的树脂选择提供了直接依据。
（6）树脂重复使用稳定性数据，来自图S5。该数据验证了IRA-910树脂经过20次吸附-解吸循环后，吸附容量保持稳定，且β-酮己二酸可完全回收，证明了该树脂在工业化连续生产中的可行性。
（7）ISPR耦合3 L补料分批发酵数据，来自图3B和3C。该数据展示了原位产物回收对发酵性能的显著提升，有效滴度达到92.0 g/L，产率提高到0.83 g/(L·h)，同时发酵液中β-酮己二酸浓度维持在较低水平，有效缓解了产物抑制。
（8）产物纯度分析数据，来自图3D、图S6和表S2。该数据对比了传统后处理和ISPR后处理的产物纯度，证明ISPR可将纯度从88.3 wt%提升至99.0 wt%，同时显著降低了水分、levulinic acid和Fe、Mg、P、K等聚合抑制剂的含量，更适合后续的聚合反应。
（9）β-酮己二酸和粘康酸合成途径的热力学数据，来自图4。该数据通过eQuilibrator 3.0计算获得，揭示了β-酮己二酸途径具有更负的总自由能变化，从热力学角度解释了其生产性能优于粘康酸的原因，为后续代谢途径的设计和优化提供了理论指导。
（10）产物元素组成分析数据，来自图S6C。该数据通过ICP-OES测定，显示ISPR产物中钠和硫含量略有增加（源于洗脱剂和干燥剂），但其他杂质元素含量显著降低，为后续纯化工艺的优化提供了方向。
8. 结论
本研究通过整合代谢工程与生物过程工程，成功构建了能高效共利用葡萄糖和木糖生产β-酮己二酸的恶臭假单胞菌菌株GR038。在10 L补料分批发酵中，该菌株实现了65.8 g/L的产物滴度、0.69 g/(L·h)的生产速率和0.52 C-mol的碳收率，较之前的研究成果有了质的飞跃。
引入吸附式原位产物回收技术后，有效缓解了产物抑制，使有效滴度进一步提升至92.0 g/L，生产速率提高到0.83 g/(L·h)，同时将产物纯度从88.3 wt%提升至99.0 wt%，省去了活性炭脱色步骤，显著简化了下游纯化工艺。热力学分析表明，β-酮己二酸合成途径比粘康酸途径具有更有利的自由能变化，是更具工业化潜力的生物基单体生产路线。
本研究建立了从菌株改造、发酵优化到原位分离的全流程技术体系，为利用木质纤维素原料工业化生产β-酮己二酸提供了坚实的技术基础，推动了生物基高性能聚合物的可持续发展。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Bioscreen C Pro自动生长曲线分析仪，在96孔板中测定了不同基因改造菌株在以5.4 g/L葡萄糖为唯一碳源的M9基本培养基中的生长曲线，数据来自图S1。该仪器在此研究中的应用及数据的研究意义主要体现在以下五个方面：
（1）高通量快速筛选菌株表型：Bioscreen系统支持96孔板同时检测，可一次性完成多个工程菌株的生长表型分析，大幅缩短了菌株筛选周期。本研究中同时测定了LC224、GR011、GR014、GR017、GR020等多株菌株的生长曲线，快速识别出pcaIJ基因删除会导致菌株延迟期延长约12小时，而lvaE和gacS基因的删除对生长无显著负面影响，为代谢工程改造提供了及时的表型反馈。
（2）精确量化生长动力学参数：通过连续监测OD₆₀₀值的动态变化，可精确计算出各菌株的延迟期、比生长速率、最大生物量等关键生长动力学参数。这些参数定量反映了不同基因操作对菌株生理特性的影响，例如pgi-1基因的恢复使菌株在混合糖利用时的生长速率显著提高，验证了关于戊糖磷酸途径通量平衡的假设，指导了后续的菌株优化方向。
（3）标准化实验条件，提高结果重复性：Bioscreen的自动化培养和检测系统消除了人工取样带来的操作误差，严格控制温度、振荡频率等培养条件，确保了不同批次实验结果的可比性和重复性。本研究中所有菌株的生长实验均在相同的标准化条件下进行，获得的数据可靠且具有统计学意义。
（4）揭示代谢改造的生理影响：生长曲线的变化直接反映了细胞内代谢通量的重新分配。例如，pcaIJ基因删除导致β-酮己二酸无法进入三羧酸循环供能，使菌株生长延迟且最终生物量降低，这一表型变化验证了代谢通路阻断的有效性，同时也提示需要进一步优化能量代谢以提高菌株生长和生产性能。
（5）为生物反应器放大提供基础数据：小体积高通量生长实验获得的动力学参数，可用于指导生物反应器的接种量、培养时间、补料策略等工艺参数的设置。例如，根据GR038的延迟期和比生长速率，确定了生物反应器的种子培养时间和初始接种量，确保了放大过程的顺利进行，加速了工艺开发进程。