Evaluation of different nitrogen sources on growth and fermentation performance for enhancing ethanol production by wine yeasts
不同氮源对酿酒酵母生长与发酵性能的影响及其提升乙醇产量的作用评估
来源：Heliyon 9 (2023) e22608
1.论文摘要核心内容
低酿酒价值葡萄品种的葡萄汁用于生物乙醇生产，是葡萄种植业多元化发展与产品增值的重要途径；超高重力（VHG）发酵技术可显著提升乙醇生产效率，同时降低生产过程中的水耗与能耗。本研究探究了不同氮源对本地筛选酵母菌株生长与发酵性能的影响，对3株酿酒酵母本地菌株、1株商业酿酒酵母菌株、1株鲁氏接合酵母菌株，在合成培养基与天然葡萄汁体系中，分别添加不同浓度的磷酸氢二铵（NH）、酵母提取物（YE）、商业发酵助剂Fermaid K（FERM）与尿素（U）进行发酵培养。其中鲁氏接合酵母因发酵速率极低被排除出后续研究。合成培养基实验结果显示，能显著促进酵母生长的氮源（硫酸铵与酵母提取物）对发酵性能的影响极小，且该效应高度依赖酵母菌株的特异性；而尿素与硫酸铵的组合可显著提升糖消耗速率。在天然葡萄汁体系中验证发现，低浓度尿素+硫酸铵组合（300+75 mg/L）可同时提升菌株生长参数与乙醇得率，将该组合浓度加倍（600+150 mg/L）可进一步提升糖消耗效率与乙醇产量，同时减少乙酸、甘油等不利副产物的生成。尿素与硫酸铵的组合使用具有显著的协同效应，是超高重力发酵体系中一种经济高效的氮源补充剂。
2.中文关键词（单行）
氮、酵母生长、发酵、乙醇
3.研究目的
核心目的：系统评估不同氮源的种类与添加浓度对酿酒酵母（包括本地筛选菌株与商业标准菌株）生长、发酵性能的影响，筛选出适配超高重力（VHG）葡萄汁发酵体系的最优氮源补充方案，提升低酿酒价值葡萄汁的生物乙醇转化效率。
产业痛点解决：针对阿根廷主产区大量低酿酒价值葡萄产能过剩的行业问题，探索其生物乙醇转化的可行路径，实现葡萄种植业的产业多元化与产品增值；同时破解VHG发酵中酵母易受高渗透压、高乙醇胁迫，出现发酵迟滞、停滞、残糖不完全的行业共性难题。
机制与适配性研究：明确不同氮源对酵母生长与发酵性能影响的菌株特异性，厘清“促进生长的氮源”与“提升发酵性能的氮源”之间的差异与关联，为不同酵母菌株匹配精准、适配的氮源营养方案。
工业化经济性优化：筛选出低成本、高效能的工业级氮源组合，降低生物乙醇生产的原料成本，同时减少发酵副产物生成，提升乙醇生产的工业化经济性与产品品质。
4.研究思路
本研究采用“体系建立-高通量初筛-统计分析-体系验证-结论总结”的递进式研究思路，核心流程如下：
第一步，实验体系与材料建立：以3株本地筛选酿酒酵母、1株商业酿酒酵母Lalvin EC1118、1株鲁氏接合酵母为研究对象，选择工业发酵中4种常用氮源（酵母提取物YE、磷酸氢二铵NH、Fermaid K、尿素U），构建总糖300 g/L的超高糖合成培养基，模拟VHG发酵的高渗透压环境。
第二步，合成培养基高通量初筛：在合成培养基中，评估4种氮源4个浓度梯度（150、300、450、600 mg/L）对5株酵母的影响，通过芬兰Bioscreen C仪器实时监测酵母生长曲线，拟合Gompertz模型获得最大生物量、最大比生长速率、延迟期等核心生长参数；通过HPLC检测发酵终点的残糖与乙醇含量，计算乙醇得率与糖消耗率等发酵参数。
第三步，数据统计与候选方案筛选：通过多变量方差分析（MANOVA）、主成分分析（PCA），明确不同氮源对酵母生长与发酵的影响规律，排除发酵性能极差的鲁氏接合酵母；筛选出对各菌株生长无负面影响、能显著提升发酵性能的氮源方案，包括不同浓度的YE，以及尿素+硫酸铵组合（600+150 mg/L），确定天然葡萄汁验证的候选方案。
第四步，天然葡萄汁体系验证：将初筛的氮源方案在总糖390 g/L的天然葡萄汁VHG发酵体系中进行验证，通过失重法监测发酵进程，检测终点的生长参数、发酵参数，同时通过傅里叶变换红外光谱检测乙酸、甘油等副产物含量；结合PCA分析与统计学检验，评估不同氮源方案在真实发酵体系中的综合性能。
第五步，结果分析与结论总结：综合合成培养基与天然葡萄汁的全流程实验结果，明确尿素与硫酸铵组合对本地酿酒酵母VHG发酵的协同增效效应，解析不同氮源影响酵母生长与发酵的内在规律，最终确定适配本地菌株的低成本、高效能氮源补充方案，形成研究结论。
5.研究亮点
首次针对阿根廷本土酿酒酵母菌株，系统评估了不同氮源在超高重力葡萄汁发酵体系中的作用效应，明确了本土菌株的氮源需求与代谢特征，填补了本地菌株VHG发酵营养优化的研究空白，为低酿酒价值葡萄的生物乙醇转化提供了菌株与工艺的双重支撑。
发现了尿素与硫酸铵组合的协同增效效应，该组合不仅能同时提升酵母的生长性能、糖消耗速率与乙醇产量，还能显著减少乙酸、甘油等不利副产物的生成，破解了单一氮源“促生长不促发酵”或“高成本难以工业化”的行业痛点。
证实了酵母氮源利用的显著菌株特异性，明确了“促进酵母生长的氮源”与“提升发酵性能的氮源”并非完全匹配，打破了“高生物量=高发酵效率”的传统认知，为酿酒酵母VHG发酵的氮源精准优化提供了新的理论依据。
开发了极具工业经济性的氮源补充方案，600+150 mg/L的尿素+硫酸铵组合，相较于酵母提取物、商业发酵助剂Fermaid K，原料成本大幅降低，同时在VHG发酵中表现出更优的综合性能，为工业规模生物乙醇生产提供了低成本、可直接落地的工艺方案。
构建了从合成培养基高通量初筛到天然葡萄汁体系验证的完整研究范式，结合生长动力学模型拟合、多变量统计分析，实现了氮源方案的高效筛选与精准验证，为其他发酵体系的营养优化提供了可复制的研究方法。
6.可延伸的研究方向
基于本研究筛选的最优氮源方案，开展发酵工艺放大优化，在5 L-500 L中试生物反应器中优化补料分批发酵、连续发酵的工艺参数，解决高糖体系下的溶氧、渗透压胁迫问题，进一步提升乙醇生产效率与批次稳定性，推动工艺的工业化落地。
深入解析尿素与硫酸铵协同促进VHG发酵的分子机制，通过转录组、代谢组多组学分析，明确该氮源组合对酵母氮代谢、糖酵解通路、乙醇胁迫响应、副产物合成通路的调控规律，从分子层面揭示其协同增效的内在机理。
针对本研究中的本地酿酒酵母菌株，通过适应性实验室进化进一步提升其在超高糖、高乙醇浓度下的耐受性与发酵性能，结合代谢工程改造阻断甘油、乙酸等副产物合成通路，进一步提升乙醇得率。
拓展氮源方案的适用场景，验证该尿素+硫酸铵组合在玉米、甘蔗、木质纤维素水解液等其他原料的乙醇VHG发酵体系中的适用性，开发通用型的低成本氮源补充方案。
开展不同氮源组合的全流程技术经济性分析，结合工业生产的原料成本、能耗、发酵周期、乙醇得率等参数，构建技术经济模型，量化该方案的工业应用经济效益。
探究氮源方案与其他发酵助剂（无机盐、维生素、表面活性剂等）的协同作用，开发复合营养补充剂，进一步优化VHG发酵体系，缩短发酵周期，提升乙醇生产强度。
研究不同氮源对酵母菌体活力、发酵副产物谱的影响，评估该氮源方案对酒糟后续资源化利用（蛋白饲料、沼气发酵）的影响，实现生物乙醇生产全链条的增值与绿色化。
7.测量的数据、对应图表及研究意义
不同氮源对酵母生长与发酵参数的全局影响统计数据，包括最大生物量A、最大比生长速率μmax、乙醇得率Yp/s、糖消耗率%SC的均值与标准差，来自Table 1。研究意义：从全局层面明确了不同氮源的核心作用效应，证实磷酸氢二铵（NH）能最显著提升酵母的最大生物量与生长速率，而尿素+硫酸铵组合（U+NH）可实现最高的糖消耗率，为后续菌株特异性分析与氮源筛选提供了整体的统计学依据。
不同酵母菌株在不同氮源下的生长参数（A、μmax）与发酵参数（Yp/s、%SC）的组间对比数据，来自Fig 1A-D。研究意义：直观呈现了氮源对酵母生长与发酵影响的菌株特异性，证实鲁氏接合酵母的发酵性能显著低于其他酿酒酵母菌株，为排除该菌株、锁定4株酿酒酵母为后续研究对象提供了直接实验依据；同时明确了不同菌株对氮源的响应差异，为菌株特异性的氮源方案优化奠定了基础。
不同氮源处理下，各酵母菌株生长与发酵参数的主成分分析（PCA）二维散点图与载荷向量数据，来自Fig 2。研究意义：可视化呈现了不同氮源处理与生长、发酵参数的关联关系，证实硫酸铵处理主要与生长参数强相关，而尿素+硫酸铵组合与糖消耗率强相关；同时明确了不同菌株的最优氮源处理方向，为各菌株筛选适配的氮源方案提供了多变量统计层面的核心支撑。
合成培养基中，不同氮源、不同浓度处理下，4株酿酒酵母的生长参数（A、μmax）与发酵参数（Yp/s、%SC）的详细统计数据，来自Table 2。研究意义：量化了不同氮源浓度对各菌株生长与发酵的具体影响，筛选出了对各菌株生长与发酵均无负面影响、能提升发酵性能的酵母提取物（YE）处理组，以及尿素+硫酸铵组合处理组，为天然葡萄汁验证实验确定了具体的候选氮源方案，是衔接初筛与验证实验的核心数据支撑。
天然葡萄汁体系中，不同氮源处理下各菌株生长、发酵参数与发酵产物的主成分分析（PCA）二维散点图与载荷向量数据，来自Fig 3。研究意义：在真实发酵体系中明确了不同氮源处理的综合性能，证实低浓度尿素+硫酸铵组合与生长、乙醇得率相关，高浓度组合与糖消耗率、最终乙醇浓度相关，而酵母提取物、单一尿素处理与乙酸、甘油等副产物强相关；为最终确定最优氮源方案提供了多维度的统计学依据。
天然葡萄汁体系中，不同氮源处理下各菌株的生长参数（A、μmax）、发酵参数（Yp/s、%SC）、乙醇体积分数、乙酸与甘油含量的详细统计数据，来自Table 3。研究意义：量化了不同氮源方案在天然葡萄汁VHG发酵中的实际效果，证实600+150 mg/L的尿素+硫酸铵组合对3株本地酿酒酵母，可实现最高的糖消耗率、乙醇浓度，同时副产物含量最低；明确了商业菌株与本地菌株的氮源响应差异，为最终研究结论提供了核心的实验数据支撑。
8.研究结论
本研究系统评估了不同氮源对酿酒酵母生长与发酵性能的影响，明确了酵母对氮源的利用具有显著的菌株特异性，且促进酵母生长的氮源与提升发酵性能的氮源并非完全匹配，打破了“高生物量等同于高发酵效率”的传统认知。
单一氮源中，磷酸氢二铵可显著提升酵母的生长性能，但对发酵性能的提升作用有限；酵母提取物可同时提升酵母生长与乙醇得率，但其原料成本较高，难以适配工业化大规模生物乙醇生产。
尿素与硫酸铵的组合使用具有显著的协同增效效应，其中300+75 mg/L的低浓度组合可同时提升本地酿酒酵母的生长参数与乙醇得率；浓度加倍至600+150 mg/L后，可进一步提升糖消耗速率与最终乙醇产量，同时显著降低乙酸、甘油等不利副产物的生成，是适配本地酿酒酵母VHG发酵的最优氮源方案。
商业酿酒酵母EC1118对氮源的响应与本地菌株存在显著差异，酵母提取物处理对其生长与发酵性能的提升效果最优，而尿素+硫酸铵组合也可显著提升其发酵性能。
本研究证实，600+150 mg/L的尿素与硫酸铵组合，是高糖葡萄汁VHG发酵中一种高效、低成本的氮源补充剂，可有效提升低酿酒价值葡萄汁的生物乙醇转化效率，为阿根廷葡萄产区过剩葡萄的资源化利用、产业多元化发展提供了可行的技术方案。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义详细解读
本研究中使用的芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪，核心用于合成培养基中不同氮源处理下5株酵母的生长曲线实时监测，其测量的生长曲线数据是整个研究的基础核心数据，贯穿了菌株初筛、氮源效应评估、生长动力学参数解析的全流程，核心研究意义分为以下6个层面：
第一，为酵母生长动力学的精准解析提供了高时间分辨率的全周期数据，实现了氮源效应的定量化表征。
本研究中，Bioscreen C仪器在28℃恒温培养条件下，每2小时对100孔板中的样本进行8秒预振荡后检测OD600值，连续监测长达15天，获得了不同氮源、不同浓度、不同菌株下酵母生长的全周期动态数据。相较于传统的人工取样、分光光度计单点检测方法，该仪器彻底消除了人工操作的系统误差、批次间环境波动干扰，实现了对酵母延迟期、对数生长期、稳定期的无间断、高频率监测。基于该仪器获得的生长曲线数据，研究团队通过Gompertz模型非线性拟合，精准提取了最大生物量A、最大比生长速率μmax、延迟期λ三个核心生长动力学参数，拟合优度R²达0.97~1，数据可靠性极高。这些定量化的动力学参数，首次精准表征了不同氮源对酵母生长的促进/抑制效应，明确了磷酸氢二铵是最能提升酵母生长速率与生物量的单一氮源，为不同氮源的生长效应排序提供了直接、精准的量化依据。
第二，实现了多菌株、多氮源、多浓度梯度的高通量平行筛选，大幅提升了实验效率与数据可比性。
本研究的初筛阶段需要评估5株酵母、4种氮源、4个浓度梯度，加上尿素+硫酸铵组合处理，总计195个实验单元，每个处理设置3个生物学重复。Bioscreen C仪器的100孔板设计，可在单次实验中完成数十个处理的同步培养与生长监测，确保所有样本的培养温度、振荡条件、检测时间、环境参数完全一致，彻底消除了摇瓶分批培养带来的批次间误差，保证了不同菌株、不同氮源处理之间生长数据的横向可比性。通过该仪器的高通量检测，研究团队在单次实验中就完成了所有处理的生长曲线测定，快速排除了发酵性能极差的鲁氏接合酵母，大幅缩短了初筛周期，提升了候选氮源方案的筛选效率，为工业发酵助剂的多因素高通量筛选提供了高效的技术平台。
第三，精准验证了酵母对高糖环境的适应性，为VHG发酵体系的菌株筛选提供了核心依据。
本研究的合成培养基总糖浓度达300 g/L，属于典型的超高重力发酵体系，酵母在该环境下会面临强烈的渗透压胁迫，易出现长延迟期、生长停滞等问题。Bioscreen C仪器的连续生长曲线监测，精准捕捉了所有酵母菌株在高糖环境下的生长启动时间、延迟期时长、对数期生长速率，证实所有酿酒酵母菌株均无延迟期（λ=0 h），说明其对300 g/L的高糖环境具有良好的适应性，而鲁氏接合酵母生长与发酵性能极差，从而完成了VHG发酵适配菌株的初筛。这一数据直接验证了菌株对高渗透压胁迫的耐受能力，为后续天然葡萄汁390 g/L超高糖体系的发酵实验，提供了菌株适应性的前置验证，确保了后续验证实验的可行性。
第四，为“生长与发酵解耦”的核心发现提供了直接的实验支撑，打破了传统认知。
传统发酵理论通常认为，更高的生物量会带来更快的发酵速率与更高的产物得率。本研究中，通过Bioscreen C获得的生长动力学数据，结合HPLC检测的发酵终点参数，研究团队发现了核心规律：硫酸铵处理能带来最高的生物量与生长速率，但其对乙醇得率、糖消耗率的提升效果并不显著；而尿素+硫酸铵组合处理，生长参数仅处于中等水平，却能实现最高的糖消耗率与优异的乙醇得率。这一发现直接证实了酵母的生长性能与发酵性能并非完全正相关，二者存在解耦效应，而Bioscreen C提供的精准、可重复的生长动力学数据，是这一核心发现的关键实验基础。如果没有该仪器提供的全周期、定量化生长数据，仅通过终点法检测生物量，无法精准区分不同氮源对生长速率、最大生物量的影响，也无法实现生长与发酵性能的精准关联分析。
第五，为后续天然葡萄汁验证实验的氮源方案选择提供了标准化的筛选标尺。
基于Bioscreen C获得的生长曲线与拟合的动力学参数，研究团队通过MANOVA与PCA分析，系统评估了不同氮源处理对各菌株生长的影响，筛选出了既不会抑制酵母生长，又能适配发酵性能提升的氮源方案：包括不同浓度的酵母提取物，以及尿素+硫酸铵组合。这些筛选出的方案，均经过了生长曲线数据的验证，确保其在高糖环境下不会对酵母的基本生理活性产生负面影响，从而避免了在天然葡萄汁验证实验中出现“因生长抑制导致发酵性能下降”的假阴性结果。该仪器提供的生长数据，为整个研究的氮源方案筛选建立了“无生长抑制”的核心金标准，确保了后续发酵性能验证实验的科学性与严谨性。
第六，为菌株特异性的氮源需求解析提供了高可靠性的基础数据，推动了本土菌株的精准营养优化。
本研究的核心研究对象是阿根廷本地筛选的酿酒酵母菌株，其氮源代谢特征、高糖环境适应性与商业菌株存在显著差异。Bioscreen C仪器提供的平行、可重复的生长曲线数据，精准呈现了3株本地菌株与商业菌株EC1118对不同氮源的生长响应差异：例如本地菌株G、C在硫酸铵处理下的生物量提升幅度显著高于其他氮源，而商业菌株E对酵母提取物的生长响应更优。这些菌株特异性的生长数据，为不同菌株匹配了个性化的氮源优化方案，也为本土酿酒酵母的生理特征研究、发酵工艺定制化开发提供了基础的生理数据支撑，填补了本地菌株氮代谢特征的研究空白。