Increased apoptosis, reduced Wnt/β-catenin signaling, and altered tail development in zebrafish embryos exposed to a human-relevant chemical mixture
暴露于人类相关化学混合物的斑马鱼胚胎中细胞凋亡增加、Wnt/β-连环蛋白信号传导减弱及尾部发育改变
来源：Chemosphere 264 (2021) 128467
1. 摘要
人类和野生动物体内已检测到多种人为产生的化学物质，但其暴露带来的健康影响尚不明确。生命早期阶段对化学干扰最为敏感，发育阶段的暴露可能导致成年后患病，但相关作用机制的研究仍不充分。本研究依托欧盟EDC-MixRisk项目，基于瑞典SELMA妊娠队列数据，确定了与新生儿出生体重呈负相关的化学混合物G，其由5种邻苯二甲酸单酯、三氯生及3种全氟烷基酸组成。研究以斑马鱼胚胎为模型，通过TUNEL染色、caspase-3活性检测和吖啶橙染色评估细胞凋亡，利用表达EGFP报告基因的转基因斑马鱼品系检测Wnt/β-连环蛋白信号传导。结果发现，在仅比人类队列几何平均血清浓度高20-100倍的水浓度下，混合物G即可诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡，抑制尾鳍中的Wnt/β-连环蛋白信号传导，并改变尾鳍形态。该研究结果提示，类似混合物G的污染物混合物可能干扰多种基础发育过程，进而产生不良健康影响。
2. 关键词（中文）
混合物、斑马鱼胚胎、Wnt/β-连环蛋白、细胞凋亡、全氟辛烷磺酸
3. 研究目的
探究与人类新生儿低出生体重相关的化学混合物G对斑马鱼胚胎早期发育的影响，明确其是否通过干扰细胞凋亡和/或Wnt/β-连环蛋白信号传导这两个进化保守的关键发育通路导致发育异常，为化学混合物的发育毒性机制研究及风险评估提供实验依据。
4. 研究思路
首先基于瑞典SELMA妊娠队列中孕妇孕10周左右的化学物质暴露水平与新生儿出生体重的负相关关系，确定由9种环境污染物组成的混合物G及其摩尔混合比例。随后以野生型AB品系和Tg(6xTcf/Lef BS-miniP:d2EGFP)isi04转基因斑马鱼胚胎为实验模型，从3-4小时受精后（hpf）开始进行水体暴露，设置1x、20x、100x hsc（人类血清几何平均浓度倍数）的混合物G浓度组，同时设置XAV939（Wnt通路抑制剂）和PFOS（凋亡诱导剂）作为阳性对照。按照预设的时间节点（图1），分别检测细胞凋亡、Wnt/β-连环蛋白信号传导、尾鳍形态、胚胎标准长度、相关基因mRNA表达及孵化率等指标。通过多种实验方法交叉验证结果，结合统计学分析，明确混合物G对斑马鱼胚胎发育的毒性效应及潜在作用机制。
5. 研究亮点
（1）研究对象具有高度人类相关性：混合物G的组成和比例完全基于真实人群（瑞典SELMA妊娠队列）的暴露数据，而非人为随意配制，其毒性效应更能反映人类实际暴露的健康风险。
（2）多方法交叉验证核心结果：采用吖啶橙染色、TUNEL染色和caspase-3活性检测三种独立方法评估细胞凋亡，同时结合CellProfiler自动化图像分析和ImageJ手动图像分析两种方式定量Wnt/β-连环蛋白信号，结果可靠性高。
（3）效应浓度接近人类实际暴露水平：在仅比人类血清几何平均浓度高20-100倍的浓度下即观察到显著发育毒性效应，而队列中部分孕妇的暴露水平已接近该效应浓度范围，提示该混合物的健康风险不容忽视。
（4）揭示新的发育毒性机制：首次发现该人类相关化学混合物可同时干扰细胞凋亡和Wnt/β-连环蛋白信号传导通路，并导致尾鳍形态异常，为解释其与低出生体重的关联提供了新的机制线索。
6. 可延伸的研究方向
（1）探究混合物G对人类胎盘细胞的影响：验证其是否能诱导人类胎盘细胞凋亡、抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导，进而导致胎盘功能障碍和胎儿生长受限，明确从动物实验到人类的外推性。
（2）开展更低浓度的长期暴露研究：评估接近人类实际暴露水平（1x hsc及以下）的混合物G在整个生命周期中的慢性毒性效应，尤其是对成年后代谢、生殖等系统的远期影响。
（3）解析混合物中各组分的相互作用：通过单组分和不同组合的暴露实验，明确各组分在混合物毒性效应中的贡献及协同、拮抗作用机制。
（4）探索其他发育相关信号通路的变化：除Wnt/β-连环蛋白和凋亡通路外，研究混合物G对Hedgehog、Notch等其他关键发育信号通路的影响，全面揭示其发育毒性的分子网络。
（5）开展不同物种的比较研究：在啮齿类等哺乳动物模型中验证混合物G的发育毒性效应，进一步完善化学混合物的风险评估体系。
7. 测量的数据及研究意义
（1）Wnt/β-连环蛋白信号传导相关数据：通过转基因斑马鱼的EGFP荧光强度定量，包括CellProfiler自动化分析的尾鳍圆形区域总荧光（图2C、图2D），以及ImageJ手动分析的尾鳍特定区域A的面积、平均荧光强度和总荧光强度（图3B-3G）。这些数据直接证明了混合物G可显著抑制斑马鱼胚胎尾鳍中的Wnt/β-连环蛋白信号传导，且效应强度与浓度相关，为揭示其发育毒性机制提供了核心分子证据。
（2）尾鳍形态学数据：测量了尾鳍尖端长度a、尾鳍总高度b、脊索尖端前300像素处的尾部总高度c和无鳍尾部高度d（图4B-4I），同时测定了胚胎标准长度。结果显示混合物G可特异性改变尾鳍高度而不影响整体体长，表明其对尾鳍发育的干扰具有组织特异性，直观反映了混合物G的形态发育毒性。
（3）细胞凋亡相关数据：①吖啶橙染色数据，包括完整胚胎的荧光强度和胚胎匀浆上清液的荧光强度，检测了36、60、84 hpf三个时间点（图5B、图S2）；②TUNEL染色数据，计数了54、78、102 hpf尾鳍中的凋亡细胞斑点数（图6B、6C）；③caspase-3样活性数据，通过检测底物水解产物pNA的吸光度，测定了78 hpf的caspase-3活性（图7、图S3）。三种方法的结果相互印证，明确了混合物G的促凋亡效应及其时间和浓度依赖性，是其发育毒性的重要机制之一。
（4）基因表达数据：通过qPCR检测了54和78 hpf时凋亡相关基因（p53、baxa、mdm2）和氧化应激相关基因（cat、gpx1a、nrf2a）的mRNA表达水平（图S4）。结果显示这些基因的表达无显著变化，提示混合物G的促凋亡效应可能不依赖于这些基因的转录水平调控，为进一步探索其下游分子机制指明了方向。
（5）孵化率数据：统计了48、60、72 hpf野生型和转基因斑马鱼胚胎的孵化率（图S5）。结果显示混合物G对孵化率无显著影响，排除了孵化延迟或异常对其他发育指标检测结果的干扰。
8. 结论
暴露于与人类新生儿低出生体重相关的化学混合物G，可导致斑马鱼胚胎细胞凋亡增加、尾鳍中Wnt/β-连环蛋白信号传导受抑制，并伴随尾鳍形态的异常改变。这些效应表明该混合物能够干扰生物的基础发育过程，可能最终导致组织器官畸形或功能异常，进而产生不良健康影响。研究结果提示，在环境化学物质的风险评估中，应充分考虑多种污染物联合暴露的综合效应，尤其是对生命早期发育阶段的潜在危害。
9. 芬兰Bioscreen仪器测量数据的研究意义
本研究中并未使用芬兰Bioscreen C Growth Curve Analysis System测量微生物生长曲线，该仪器在本实验中被用于caspase-3样活性的检测（2.6.3 Caspase 3 assay部分）。其具体应用为：在caspase-3活性检测实验中，将含有caspase-3特异性底物Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide的反应体系与胚胎匀浆上清液共同孵育，通过Bioscreen C系统在405 nm波长下连续监测底物水解产物对硝基苯胺（pNA）的吸光度变化，从而定量caspase-3的酶活性。
该仪器在此处的应用具有以下研究意义：
（1）实现酶活性的动态连续监测：Bioscreen C系统可在长达24小时的时间内每隔2小时自动读取吸光度值，能够完整捕捉caspase-3催化底物水解的动力学过程，相较于传统终点法检测，可获得更全面的酶活性数据，避免了单一时间点检测可能带来的误差，本研究中通过4-8小时的稳定期数据确定了caspase-3的活性水平（图S3）。
（2）提高检测的通量和准确性：该系统支持96孔板同时检测，可同时处理多个样本和技术重复孔，大幅提高了实验通量；其高精度的光学检测系统能够灵敏地检测到吸光度的微小变化，确保了低水平caspase-3活性变化的准确检出，本研究中正是通过该系统准确检测到了20x和100x hsc浓度组混合物G诱导的caspase-3活性显著升高（图7）。
（3）为细胞凋亡的定量评估提供可靠生化指标：caspase-3是细胞凋亡执行阶段的关键蛋白酶，其活性水平是反映细胞凋亡程度的核心生化指标。Bioscreen C系统的精准检测为验证混合物G的促凋亡效应提供了坚实的生化证据，与吖啶橙染色和TUNEL染色的形态学结果相互补充，共同证实了混合物G的凋亡诱导作用。