Effect of β-lactam antibiotic resistance gene expression on the radio-resistance profile of E. coli O157:H7
β-内酰胺类抗生素耐药基因表达对大肠杆菌O157:H7辐射抗性特征的影响
来源：Heliyon 4 (2018) e00999
1.论文摘要核心内容
部分病原体在应对特定胁迫处理时会产生有利的全局适应性，进而导致毒力增强和/或对其他胁迫的抗性提升。本研究围绕β-内酰胺耐药性，以及参与该耐药过程的ampC、ampG基因展开，评估其在大肠杆菌O157:H7辐射抗性中的潜在作用。研究构建了分别适配25、15、7 mg/mL卡那霉素或羧苄西林的大肠杆菌菌株，对其进行0.4 kGy致敏剂量或1.5 kGy致死剂量的辐照处理。结果显示，0.4 kGy辐照处理可使野生型菌株（Wt）的ampC和ampG表达分别上调1.6倍和2倍，而预先适配25 mg/mL羧苄西林的菌株（Carb25）中，两基因表达上调幅度最高可达2.4倍和3.4倍。相应地，ΔampC、ΔampG基因敲除突变株，以及适配25 mg/mL卡那霉素的大肠杆菌菌株，对0.4 kGy辐照处理的敏感性显著高于野生型；而Carb25菌株或过表达ampC、ampG的菌株，对0.4 kGy辐照完全耐受，甚至在暴露于通常致死的1.5 kGy辐照剂量后仍能存活和生长。研究进一步发现，这些菌株还可耐受氧化、冷热休克等其他胁迫。上述结果证实，羧苄西林适配很可能至少通过提升AmpC和AmpG的表达，促进大肠杆菌对γ辐照及其他胁迫的抗性，该结果对食品工业，尤其是饲喂β-内酰胺类抗生素的动物源肉类采用辐照保鲜的场景具有重要意义。
2.中文关键词（单行）
生物技术、微生物学、分子生物学
3.研究目的
核心评估畜牧养殖中广泛使用的β-内酰胺类抗生素的耐药性，对食源性致病菌大肠杆菌O157:H7γ辐照抗性的影响，重点解析β-内酰胺酶编码基因ampC、通透酶编码基因ampG在该调控过程中的具体作用；
明确β-内酰胺类抗生素耐药与辐照抗性之间的交叉保护效应及类别特异性，揭示其背后的分子与生理机制；
为食品工业中辐照杀菌技术的安全应用提供理论依据，尤其是针对动物源肉类辐照保鲜的有效性评估与食品安全风险管控提供实验支撑。
4.研究思路
实验体系与菌株构建：以大肠杆菌O157:H7 EDL933为研究对象，利用λ Red同源重组技术构建ampC、ampG单基因敲除突变株（ΔampC、ΔampG），同时构建pTrc99A质粒介导的ampC、ampG诱导型过表达互补载体，通过PCR、测序完成菌株验证；通过连续4次传代，分别构建适配7、15、25 mg/mL羧苄西林（β-内酰胺类）、卡那霉素（氨基糖苷类）的菌株，所有后续实验均在无抗生素培养基中进行，排除抗生素直接干扰。
辐照处理分组：选取对数生长期（OD600≈1）的所有菌株，分别设置0.4 kGy致敏剂量、1.5 kGy致死剂量的60Co γ辐照处理组，以未辐照菌株为空白对照，所有处理均设置3次生物学重复。
多维度表型检测：通过平板计数法检测辐照后菌株的活菌数（CFU/mL），评估菌株存活能力；采用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪，37℃恒温培养，每30 min检测一次OD600值，连续监测20~1500 min，获取菌株辐照后的生长动力学数据；同时检测菌株对氧化胁迫（百草枯）、50℃热休克、4℃冷休克的耐受能力。
分子机制验证：通过qRT-PCR技术，检测0.4 kGy辐照60 min后，野生型与Carb25菌株中ampC、ampG基因的转录水平，以rpoH为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量；通过药敏纸片法检测基因敲除/过表达菌株对β-内酰胺类抗生素的敏感性，验证基因功能。
统计学分析与机制推导：采用GraphPad Prism 5进行数据分析，通过t检验完成组间差异显著性分析；结合表型数据与分子检测结果，串联肽聚糖循环、氧化应激响应等通路，推导ampC、ampG介导β-内酰胺耐药与辐照抗性交叉保护的核心机制。
5.研究亮点
首次明确了β-内酰胺类抗生素耐药与大肠杆菌O157:H7 γ辐照抗性之间的直接交叉保护效应，证实羧苄西林适配可使菌株对食品工业常规杀菌辐照剂量产生完全耐受，甚至在致死剂量辐照后仍能存活增殖，填补了抗生素耐药与食品辐照杀菌有效性关联研究的空白。
通过基因敲除、过表达互补的正反验证实验，精准锁定ampC和ampG两个核心功能基因，直接证实这两个β-内酰胺耐药相关基因是介导大肠杆菌辐照抗性的关键调控因子，明确了二者与辐照抗性的因果关系，而非简单的相关性。
揭示了抗生素诱导辐照抗性的类别特异性，证实仅β-内酰胺类的羧苄西林可诱导辐照抗性，而氨基糖苷类的卡那霉素无此效应，纠正了“抗生素耐药普遍诱导辐照抗性”的模糊认知，为不同类别抗生素的食品安全风险分级提供了核心依据。
拓展了ampC/ampG基因的功能边界，证实其不仅介导β-内酰胺类抗生素耐药，还同时调控菌株对氧化、冷热胁迫的多重耐受能力，将肽聚糖循环通路与细菌全局胁迫响应网络相关联，为致病菌多重胁迫抗性机制研究提供了全新视角。
研究成果直接对接食品工业实际应用，明确了饲喂β-内酰胺类抗生素的动物源肉类中，耐药致病菌可能大幅降低辐照杀菌的有效性，为食品辐照工艺优化、畜牧养殖抗生素使用规范制定提供了直接的实验依据和风险警示。
6.可延伸的研究方向
深入解析ampC、ampG基因调控大肠杆菌辐照抗性的分子机制，通过转录组、蛋白质组学技术，筛选ampC/ampG下游调控的辐照抗性相关基因，明确其与SOS响应、氧化应激修复、肽聚糖循环通路的具体互作网络。
对Carb25适配菌株进行全基因组测序，筛选除ampC/ampG外，参与羧苄西林适配与辐照抗性获得的其他突变基因或调控元件，完善β-内酰胺耐药诱导辐照抗性的完整调控通路。
拓展研究畜牧养殖中其他常用类别抗生素（四环素类、喹诺酮类、磺胺类等）对大肠杆菌O157:H7及其他食源性致病菌（沙门氏菌、单增李斯特菌等）辐照抗性的影响，构建不同抗生素类别与致病菌辐照抗性的风险数据库。
在真实食品基质（牛肉、肉制品等）中验证耐药菌株的辐照抗性变化，评估食品基质成分对耐药菌株辐照耐受性的影响，优化针对耐药致病菌的食品辐照杀菌工艺参数，提升实际生产中的杀菌有效性。
探究β-内酰胺耐药菌株辐照抗性提升后，其毒力、致病性及宿主肠道定殖能力的同步变化，全面评估该类耐药菌株对消费者健康的潜在风险，为食品安全风险管控提供更完善的依据。
研发靶向抑制ampC/ampG基因的策略，评估其能否逆转耐药菌株的辐照抗性，开发可与辐照技术联用的抑菌增效剂，解决耐药致病菌辐照杀菌效率不足的行业痛点。
7.测量的数据、对应图表及研究意义
羧苄西林适配菌株的传代生长曲线数据，来自Fig. 1。具体检测了大肠杆菌O157:H7在7、15、25 mg/mL羧苄西林培养基中，连续4次传代过程中OD600值随时间的变化。研究意义：验证了菌株对羧苄西林的适应性驯化过程，明确了传代次数与抗生素浓度对菌株生长速率的影响，完成了适配菌株的标准化构建，为后续辐照抗性实验提供了生理状态一致的实验菌株。
卡那霉素适配菌株的传代生长曲线数据，来自Fig. 2。具体检测了大肠杆菌O157:H7在7、15、25 mg/mL卡那霉素培养基中，连续4次传代过程中OD600值随时间的变化。研究意义：完成了卡那霉素适配菌株的构建与验证，与羧苄西林适配菌株形成阴性对照，为后续证实辐照抗性的抗生素类别特异性提供了基础菌株数据，排除了抗生素适配的非特异性干扰。
羧苄西林适配菌株0.4 kGy辐照后的活菌数数据，来自Fig. 3。具体检测了野生型、7/15/25 mg/mL羧苄西林适配菌株经0.4 kGy辐照后的活菌数（log10 CFU/mL），与未辐照对照组对比。研究意义：直接证实羧苄西林适配可使菌株对0.4 kGy致敏辐照剂量产生完全抗性，野生型菌株辐照后活菌数显著下降，而适配菌株活菌数无显著变化，首次明确了β-内酰胺适配对菌株辐照存活能力的提升效应。
羧苄西林适配菌株0.4 kGy辐照后的生长动力学数据，来自Fig. 4。具体通过Bioscreen C仪器检测了野生型、7/15/25 mg/mL羧苄西林适配菌株经0.4 kGy辐照后20 h内的OD600生长曲线，与未辐照对照组对比。研究意义：从生长恢复能力层面验证了羧苄西林适配菌株的辐照抗性，明确Carb25、Carb15菌株辐照后可完全恢复生长，而野生型菌株生长显著受抑，补充了静态活菌数数据，动态反映了菌株辐照后的增殖能力变化。
卡那霉素适配菌株0.4 kGy辐照后的活菌数数据，来自Fig. 5。具体检测了野生型、7/15/25 mg/mL卡那霉素适配菌株经0.4 kGy辐照后的活菌数（log10 CFU/mL），与未辐照对照组对比。研究意义：证实卡那霉素适配无法提升菌株对0.4 kGy辐照的抗性，适配菌株辐照后活菌数下降幅度甚至高于野生型，与羧苄西林适配组形成鲜明对照，明确了β-内酰胺类抗生素诱导辐照抗性的类别特异性。
卡那霉素适配菌株0.4 kGy辐照后的生长动力学数据，来自Fig. 6。具体通过Bioscreen C仪器检测了野生型、7/15/25 mg/mL卡那霉素适配菌株经0.4 kGy辐照后20 h内的OD600生长曲线，与未辐照对照组对比。研究意义：从生长动力学层面验证了卡那霉素适配无辐照抗性诱导效应，适配菌株辐照后生长能力与野生型同步显著受抑，进一步排除了抗生素适配的非特异性效应，锁定了β-内酰胺类抗生素的特异性作用。
辐照后ampC、ampG基因的相对表达量数据，来自Fig. 7。具体通过qRT-PCR检测了0.4 kGy辐照60 min后，野生型菌株、Carb25菌株中ampC、ampG基因的相对转录水平（log2 RNA表达量）。研究意义：从分子层面证实辐照可显著上调ampC、ampG基因的表达，且Carb25菌株中两基因的上调幅度远高于野生型，直接将β-内酰胺耐药相关基因的表达与菌株辐照响应相关联，为机制解析提供了核心分子证据。
基因敲除菌株的抗生素药敏实验数据，来自Fig. 8。具体检测了ΔampC、ΔampG突变株对氨苄西林、哌拉西林、羧苄西林、卡那霉素的抑菌圈面积，评估抗生素敏感性。研究意义：验证了ampC、ampG基因敲除后，菌株对β-内酰胺类抗生素的敏感性显著提升，确认了两基因在β-内酰胺耐药中的核心功能，为后续敲除菌株的辐照抗性实验提供了基因功能验证的基础。
ampC/ampG敲除与过表达菌株辐照后的活菌数数据，来自Fig. 9。具体检测了野生型、ΔampC/ΔampG突变株、ampC/ampG过表达互补菌株，经0.4 kGy、1.5 kGy辐照后的活菌数（log10 CFU/mL）。研究意义：通过正反验证实验，直接证实ampC、ampG基因是介导菌株辐照抗性的核心因子——基因敲除后菌株辐照敏感性显著提升，而过表达后菌株不仅对0.4 kGy完全耐受，还能在1.5 kGy致死辐照后存活，为两基因的功能提供了最直接的因果证据。
ampC/ampG敲除与过表达菌株辐照后的生长动力学数据，来自Fig. 10。具体通过Bioscreen C仪器检测了ΔampC/ΔampG突变株、ampC/ampG过表达互补菌株，经0.4 kGy、1.5 kGy辐照后1500 min内的OD600生长曲线。研究意义：动态验证了ampC/ampG基因对菌株辐照后生长恢复能力的调控作用，敲除菌株辐照后完全无法生长，而过表达菌株在致死剂量辐照后仍能正常增殖，进一步夯实了两基因在辐照抗性中的核心作用。
不同菌株冷热胁迫后的活菌数数据，来自Fig. 11。具体检测了野生型、ΔampC/ΔampG突变株、Carb25菌株、ampC/ampG过表达菌株，经50℃热休克2 h、4℃冷休克1周后的活菌数（log10 CFU/mL）。研究意义：证实ampC/ampG基因的高表达不仅介导辐照抗性，还同时提升菌株对冷热胁迫的耐受能力，拓展了两基因的功能边界，揭示了其在细菌多重胁迫响应中的广谱作用。
不同菌株氧化胁迫后的活菌数数据，来自Fig. 12。具体检测了野生型、ΔampC/ΔampG突变株、Carb25菌株、ampC/ampG过表达菌株，经0.5 mM、1 mM百草枯处理后的活菌数（log10 CFU/mL）。研究意义：证实ampC/ampG基因可提升菌株对氧化胁迫的抗性，而γ辐照的杀菌核心机制正是通过水辐解产生活性氧引发氧化损伤，为β-内酰胺耐药诱导辐照抗性提供了关键的机制解释。
实验所用大肠杆菌菌株与质粒的信息数据，来自Table 1。具体统计了野生型菌株、基因敲除菌株、相关质粒的基因型、描述与来源。研究意义：明确了本研究的实验材料背景，保证了实验的可重复性，为后续相关研究提供了菌株与质粒的参考信息。
实验所用引物序列数据，来自Table 2。具体包含同源重组、基因过表达、菌株验证、qRT-PCR所用的上下游引物序列。研究意义：保证了基因操作、基因表达检测实验的准确性与可重复性，为后续相关基因的功能研究提供了可参考的引物序列。
8.研究结论
大肠杆菌O157:H7对β-内酰胺类抗生素羧苄西林的适应性，可显著提升其对γ辐照的抗性，该效应具有抗生素类别特异性——氨基糖苷类抗生素卡那霉素的适配无法诱导菌株产生辐照抗性。
β-内酰胺耐药相关的ampC和ampG基因，是调控大肠杆菌O157:H7辐照抗性的核心关键基因；辐照处理可显著上调这两个基因的转录水平，羧苄西林适配菌株中上调幅度更为显著；基因敲除会使菌株对辐照的敏感性大幅提升，而基因过表达可使菌株对0.4 kGy致敏辐照剂量完全耐受，甚至在1.5 kGy致死辐照剂量下仍能存活和生长。
ampC和ampG基因的高表达，还可同时赋予大肠杆菌O157:H7对氧化胁迫、热休克、冷休克等多种环境胁迫的耐受能力，证实其参与了细菌的全局胁迫响应调控。
ampC、ampG基因介导辐照抗性的机制，与其调控的肽聚糖循环通路密切相关，同时可能通过AmpR调控因子参与氧化应激响应、SOS响应等通路，进而提升菌株对辐照引发的氧化损伤的修复与耐受能力。
本研究结果对食品工业具有重要的警示意义，尤其是针对饲喂β-内酰胺类抗生素的动物源肉类，其中的耐药大肠杆菌O157:H7可能会显著降低辐照保鲜杀菌的有效性，给食品安全带来潜在风险。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义详细解读
本研究中采用芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪，对不同处理组的大肠杆菌O157:H7菌株进行了高通量、实时动态的生长监测，核心检测场景包括：羧苄西林/卡那霉素适配菌株的传代生长监测（Fig.1、Fig.2）、0.4 kGy辐照后野生型与抗生素适配菌株的生长恢复监测（Fig.4、Fig.6）、0.4 kGy/1.5 kGy辐照后ampC/ampG敲除与过表达菌株的生长能力监测（Fig.10）。仪器在37℃恒温条件下，每30分钟对样品进行30秒均质化处理后，检测600 nm处的光密度值（OD600），连续监测时长覆盖20 h至1500 min，获得了各菌株完整的生长动力学曲线数据，其核心研究意义分为以下6个层面：
第一，实现了菌株适应性驯化过程的动态验证，为实验体系的标准化构建提供了核心依据。在抗生素适配菌株构建阶段，通过Bioscreen仪器连续监测4次传代过程中菌株的生长曲线（Fig.1、Fig.2），实时量化了不同浓度羧苄西林、卡那霉素对菌株生长的抑制效应，以及传代过程中菌株适应性的逐步提升。该数据直接验证了抗生素适配菌株的构建成功，明确了菌株的生长速率与传代次数、抗生素浓度的关联，保证了后续辐照实验所用菌株的生理状态一致性，排除了菌株生长状态差异对辐照抗性结果的干扰，为整个实验体系的稳定性和可重复性奠定了基础。
第二，动态量化了菌株辐照后的生长恢复能力，弥补了静态活菌数检测的局限性，全面评估了菌株的真实辐照抗性。平板计数法获得的活菌数（Fig.3、Fig.5、Fig.9）仅能反映辐照后即刻的菌株存活数量，属于静态终点数据；而Bioscreen仪器获得的连续生长曲线（Fig.4、Fig.6、Fig.10），可动态监测辐照后菌株的延迟期、对数生长期、最大生长密度等完整生长动力学参数，精准量化了菌株辐照后的增殖能力与生长恢复速率。例如，通过生长曲线明确了Carb25菌株辐照后无生长延迟期，可完全恢复正常生长，而野生型菌株生长显著停滞；同时证实ampC/ampG过表达菌株在1.5 kGy致死辐照后仍能启动增殖，而野生型与敲除菌株完全丧失生长能力。这些数据不仅验证了活菌数的结果，更从菌株生理活性层面，全面揭示了不同处理对菌株辐照后生长能力的影响，避免了仅用活菌数评估辐照抗性的片面性。
第三，实现了多组平行样品的同步高通量检测，排除了环境与操作误差，保证了实验数据的准确性与统计学效力。Bioscreen C仪器可同时处理100个样品，实现了野生型、不同抗生素适配菌株、基因敲除/过表达菌株的辐照组与对照组的同步培养与检测，所有样品的培养温度、均质化条件、检测时间完全一致，彻底排除了人工分批培养、取样检测带来的环境波动与操作误差。同时，仪器的自动化检测避免了人工取样对菌株培养环境的干扰，保证了生长曲线的连续性与真实性。所有实验均设置3次生物学重复，同步的高通量检测保证了组间平行性，为后续t检验的差异显著性分析提供了可靠的统计学数据支撑，提升了实验结论的可信度。
第四，精准验证了辐照抗性效应的抗生素类别特异性，为核心科学问题的解答提供了直接的对比数据。通过Bioscreen仪器同步获得的羧苄西林适配组（Fig.4）与卡那霉素适配组（Fig.6）的辐照后生长曲线，形成了直接的平行对照，直观且精准地证实了仅β-内酰胺类的羧苄西林适配可诱导菌株产生辐照抗性，而氨基糖苷类的卡那霉素无此效应。两组实验的菌株处理、辐照条件、培养检测参数完全一致，仅抗生素类别不同，生长曲线的显著差异直接排除了“抗生素适配本身非特异性提升胁迫抗性”的干扰，锁定了β-内酰胺类抗生素的特异性作用，为核心科学假设的验证提供了最直观的动态证据。
第五，完成了ampC、ampG基因功能的正反双向动态验证，夯实了两基因是辐照抗性核心调控因子的因果结论。通过Bioscreen仪器获得的ampC/ampG敲除菌株、过表达互补菌株辐照后的生长曲线（Fig.10），与野生型菌株形成了完整的正反验证体系：基因敲除后，菌株辐照后的生长能力完全丧失，辐照敏感性显著提升；而基因过表达后，菌株不仅在0.4 kGy辐照后生长完全不受影响，甚至在1.5 kGy致死辐照后仍能正常生长。该动态生长数据与静态活菌数数据形成互补，从菌株增殖能力的核心表型层面，直接证实了ampC、ampG基因与大肠杆菌辐照抗性之间的因果关系，而非简单的相关性，为整个研究的核心机制结论提供了最关键的表型证据。
第六，为食品工业辐照杀菌工艺的风险评估与优化提供了基础的动力学参数。本研究通过Bioscreen仪器获得的耐药菌株辐照后的生长动力学数据，明确了常规食品杀菌辐照剂量（0.4 kGy）无法抑制羧苄西林适配菌株的生长，甚至致死剂量（1.5 kGy）下菌株仍能增殖。这些数据直接揭示了β-内酰胺耐药致病菌给食品辐照杀菌带来的潜在风险，为肉类等动物源食品的辐照杀菌工艺参数优化提供了量化的参考依据；同时，菌株的生长速率、延迟期等动力学参数，也为食品货架期预测、致病菌污染风险评估提供了基础数据，推动实验室研究成果向食品工业实际安全管控的转化。