Comparison of wild-type KT2440 and genome-reduced EM42 Pseudomonas putida strains for muconate production from aromatic compounds and glucose
野生型恶臭假单胞菌KT2440与基因组精简菌株EM42利用芳香族化合物和葡萄糖生产粘康酸的性能比较
来源：Metabolic Engineering 81 (2024) 88–99
1.论文摘要核心内容
恶臭假单胞菌KT2440是一株抗逆性强、芳香族化合物代谢能力优异的模式菌株，被广泛用于生物基和废弃基原料转化生产高附加值产物。为实现该菌株的工业化驯化，前人通过理性基因组精简构建了EM42菌株，该菌株被认为具备作为工业生产底盘的多项潜在优势。本研究系统对比了KT2440与EM42衍生菌株，分别以芳香族化合物对香豆酸、葡萄糖为底物生产顺,顺-粘康酸的性能。结果意外发现，无论以哪种底物进行生产，EM42衍生菌株的综合性能均未优于KT2440衍生菌株；在生物反应器补料分批培养中，KT2440和EM42衍生菌株以对香豆酸为底物的粘康酸最高滴度分别达到45 g/L和37 g/L，以葡萄糖为底物的最高滴度分别为20 g/L和13 g/L。为解析亲本菌株的性能差异，研究分析了两株菌以芳香族化合物为唯一碳源和能源的生长特征，发现EM42菌株生长延滞期更短，但多数底物下的比生长速率显著低于KT2440；同时发现，仅在测试的最低葡萄糖浓度下，EM42衍生菌株的生长速率高于KT2440衍生菌株，葡萄糖浓度升高后该优势完全消失。转录组学分析显示，EM42的基因组精简对菌株转录水平产生了全局性影响，以葡萄糖为底物生产粘康酸的EM42衍生菌株，对葡萄糖浓度变化的基因表达调控响应能力显著降低。总体而言，研究结果强调，需进一步深入研究基因组精简对微生物代谢和生理的影响，尤其是将基因组精简菌株用于构建工业生产底盘时，必须开展针对性的性能验证。
2.关键词（中文）
恶臭假单胞菌KT2440、恶臭假单胞菌EM42、基因组精简、粘康酸、芳香族化合物分解代谢
3.研究目的
① 构建与KT2440来源粘康酸高产菌株完全等基因的EM42衍生菌株，开展头对头性能对比，验证基因组精简的EM42菌株是否能在粘康酸合成中展现出前人报道的生长、辅酶供应、抗逆性等方面的优势；
② 系统解析KT2440与EM42亲本菌株在芳香族化合物为唯一碳源时的生长动力学差异，明确基因组精简对菌株芳香族代谢、葡萄糖利用的生理影响；
③ 通过转录组学分析，揭示基因组精简对EM42菌株全局基因表达、底物浓度动态响应调控的影响，阐明两株菌粘康酸生产性能差异的核心分子机制；
④ 评估基因组精简策略在恶臭假单胞菌代谢工程构建工业生产菌株中的普适性与适用边界，为合成生物学底盘菌株的理性选择提供实验依据和理论参考。
4.研究思路
本研究以“底盘菌株等基因构建-生产性能系统评估-表型差异解析-分子机制揭示-策略适用性评估”为核心逻辑，开展全链条系统性研究，具体思路如下：
第一步，等基因工程菌株的构建与验证：基于已发表的对香豆酸产粘康酸、葡萄糖产粘康酸的菌株构建方案，在EM42底盘中分别构建与KT2440来源菌株CJ781、GB062基因型完全一致的衍生菌株CJ921和CA055；通过Nanopore+Illumina二代联合全基因组重测序，验证菌株构建的准确性，排除随机突变对菌株性能的干扰。
第二步，粘康酸生产性能的多尺度系统评估：首先通过摇瓶培养，对比等基因菌株分别以对香豆酸、葡萄糖为底物的生长、底物消耗、中间代谢物积累、粘康酸合成速率与最终产量；随后在0.5 L生物反应器中开展补料分批发酵，测试2:1和8:1两种对香豆酸/葡萄糖配比下菌株的工业化生产性能，测定粘康酸滴度、摩尔得率、生产强度等核心工业指标。
第三步，关键基因缺失的回补与单因素验证：针对EM42基因组精简中随鞭毛基因簇一同删除的脂肪酸合成关键基因fabH1，构建基因回补菌株，验证该基因缺失是否是EM42生产性能下降的原因；同时在KT2440背景中单独敲除鞭毛基因簇，验证单一鞭毛缺失对菌株产粘康酸性能的影响。
第四步，菌株生长表型的高通量系统解析：利用Bioscreen C Pro全自动生长曲线分析仪，开展微孔板高通量培养，系统测试KT2440与EM42野生型菌株以8种芳香族化合物为唯一碳源、不同浓度葡萄糖为唯一碳源时的生长动力学，测定生长延滞期、比生长速率、最大生物量等关键参数，明确基因组精简对菌株底物利用的生理影响。
第五步，性能差异的分子机制解析：通过转录组学测序，对比EM42与KT2440在对香豆酸为底物时的全局基因表达差异；对比葡萄糖产粘康酸菌株CA055与GB062在10 mM、30 mM葡萄糖浓度下的转录组变化，分析两株菌对底物浓度变化的基因表达调控响应能力差异，阐明生产性能差异的分子机制。
第六步，结论总结与策略适用性评估：整合菌株生产性能、生长表型、转录组学多维度数据，总结基因组精简在恶臭假单胞菌粘康酸合成中的应用效果，界定EM42底盘的适用场景与局限性，为微生物基因组精简策略的工业化应用提供科学依据。
5.研究亮点
① 首次在完全等基因的背景下，开展了KT2440与基因组精简EM42菌株在工业相关底物（木质纤维素来源芳香族化合物、葡萄糖）中目标产物合成的系统性头对头对比，打破了“基因组精简必然提升微生物底盘生产性能”的固有认知，明确了该策略的应用局限性与场景依赖性。
② 首次系统解析了EM42菌株在芳香族化合物为唯一碳源时的生长动力学特征，发现EM42虽生长延滞期更短，但绝大多数芳香族底物下的比生长速率显著低于KT2440，填补了EM42菌株芳香族代谢表型的研究空白，直接解释了其木质素衍生底物生产性能下降的生理基础。
③ 揭示了基因组精简对菌株全局转录调控的非预期多效性影响，发现EM42衍生菌株对葡萄糖浓度变化的基因表达动态响应能力显著丧失，同时出现全局性的基因表达下调，阐明了其高浓度葡萄糖下生产性能下降的核心分子机制。
④ 系统验证了fabH1基因缺失、单一鞭毛基因簇敲除对菌株产粘康酸性能的影响，排除了这两个关键基因组区域缺失是EM42生产性能下降的主要原因，明确了菌株性能缺陷是多基因组区域删除的综合效应，为后续EM42菌株的工程化改造提供了重要参考。
⑤ 建立了“底盘性能多尺度评估-生长表型高通量解析-分子机制多组学揭示-策略适用性边界界定”的完整研究范式，为其他微生物基因组精简底盘的工业化应用评估提供了可复制的研究框架，对合成生物学底盘菌株的理性设计与选择具有重要的指导意义。
6.可延伸的方向
① 针对EM42菌株低葡萄糖浓度下的生长优势、芳香族底物下更短延滞期的特征，开展适配性的代谢工程改造与发酵工艺优化，开发低底物浓度连续流加、快速启动的发酵工艺，挖掘其在特定场景下的粘康酸及其他高附加值产物生产潜力。
② 开展基因组精简区域的单因素功能解析，逐一验证EM42中各个删除片段对菌株芳香族代谢、底物响应调控、产物合成的独立影响，明确导致性能缺陷的关键删除区域，为理性设计新一代基因组精简的恶臭假单胞菌底盘提供精准靶点。
③ 基于转录组学发现的EM42菌株底物响应调控缺陷，开展全局转录调控网络的重构工程，恢复其对底物浓度变化的动态响应能力，同时保留基因组精简带来的有利表型，构建兼顾精简性与调控鲁棒性的新型底盘菌株。
④ 拓展两种底盘在更多底物（如木质纤维素水解液、生物质衍生废弃物、一碳底物）、更多目标产物（如聚羟基脂肪酸酯、萜类化合物、其他芳香族衍生化学品）中的性能对比，全面界定KT2440与EM42底盘的适用场景边界。
⑤ 结合代谢组学、通量组学、蛋白质组学多组学技术，系统解析基因组精简对恶臭假单胞菌中心碳代谢、芳香族分解代谢、辅酶再生、能量代谢的全局影响，揭示基因组精简的非预期多效性机制，完善微生物最小基因组的理论体系。
⑥ 开展两种底盘在工业发酵胁迫条件下（高底物/产物浓度、复杂水解液杂质、溶氧与pH波动）的抗逆性、遗传稳定性与生产性能对比，评估其在实际工业化生产中的长期应用潜力。
⑦ 开发“精准化基因组精简”新策略，在删除菌株冗余基因组区域的同时，完整保留核心代谢调控网络与环境响应能力，避免非预期的表型缺陷，实现恶臭假单胞菌底盘的定向、高效优化。
7.测量的数据、研究意义及对应图表
① 实验菌株的基因型信息数据：包含本研究使用的所有KT2440与EM42衍生菌株的完整基因型、构建来源信息，数据来自Table 1。研究意义：明确了所有实验菌株的遗传背景，确保了KT2440与EM42衍生菌株的等基因对比前提，为整个研究的菌株性能差异分析提供了最基础的遗传背景依据，也为后续相关研究提供了可重复的菌株构建参考。
② 对香豆酸产粘康酸菌株的摇瓶培养性能数据：包含KT2440来源CJ781、EM42来源CJ921菌株在摇瓶培养中的生长OD600、底物消耗、中间代谢物积累、粘康酸产量随时间的变化数据，数据来自Fig.2，补充表Table S3A。研究意义：首次在摇瓶水平完成了等基因菌株以对香豆酸为底物的粘康酸生产性能对比，发现EM42衍生菌株未展现出生产性能优势，为后续生物反应器放大实验提供了基础表型依据。
③ 不同NADPH供应模式下菌株的摇瓶生产性能数据：包含pobAR/praI不同基因型的KT2440与EM42衍生菌株的生长、粘康酸产量数据，数据来自补充图Fig.S1，补充表Table S3A。研究意义：验证了仅在NADPH受限的条件下，EM42菌株的高NADPH/NADP+比值优势才会体现，明确了EM42底盘的唯一优势场景，为其代谢工程应用提供了精准的场景参考。
④ 对香豆酸产粘康酸菌株的生物反应器发酵性能数据：包含2:1和8:1两种对香豆酸/葡萄糖配比下，CJ781和CJ921菌株的生长、底物消耗、粘康酸滴度、摩尔得率、生产强度等关键工业指标，数据来自Fig.3，补充表Table S3B。研究意义：在工业化放大的补料分批发酵中，证实了KT2440衍生菌株的粘康酸生产性能显著优于EM42菌株，明确了EM42在高底物负荷下的底物积累、生产周期缩短的核心缺陷，为工业生产中底盘菌株的选择提供了直接的放大实验依据。
⑤ 葡萄糖产粘康酸菌株的摇瓶培养性能数据：包含KT2440来源GB062、EM42来源CA055菌株的生长、葡萄糖消耗、中间代谢物积累、粘康酸产量随时间的变化数据，数据来自Fig.4，补充表Table S3C。研究意义：明确了EM42衍生菌株以葡萄糖为底物时，粘康酸合成速率显著慢于KT2440菌株，完善了两种底盘在不同底物下的性能评估体系。
⑥ 葡萄糖产粘康酸菌株的生物反应器发酵性能数据：包含GB062和CA055菌株在补料分批发酵中的生长、葡萄糖总消耗量、粘康酸最终滴度、得率、生产强度数据，数据来自Fig.5，补充图Fig.S2，补充表Table S3D。研究意义：在工业化发酵条件下，证实了KT2440衍生菌株的葡萄糖利用能力、粘康酸最终滴度和生产强度均显著优于EM42菌株，为葡萄糖基粘康酸工业化生产的底盘选择提供了决定性的实验数据。
⑦ 菌株全基因组重测序的突变分析数据：包含CA055与GB062、CJ921与CJ781之间的单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失突变分析结果，数据来自补充表Table S4。研究意义：排除了菌株构建过程中产生的随机突变是导致EM42衍生菌株生产性能下降的原因，证实了性能差异完全源于基因组精简带来的全局影响，保证了研究结论的严谨性与准确性。
⑧ fabH1基因回补菌株的性能验证数据：包含fabH1回补菌株CA117、CA116与原始菌株的生长、粘康酸生产性能数据，数据来自补充图Fig.S3，补充表Table S3E。研究意义：证实了EM42中fabH1基因的缺失并非导致其粘康酸生产性能下降的原因，排除了该关键基因缺失的干扰，缩小了后续机制解析的范围。
⑨ 鞭毛基因簇单独敲除菌株的性能验证数据：包含GB062敲除鞭毛基因簇的菌株CA042、fabH1回补菌株CA115的生长、粘康酸生产性能数据，数据来自补充图Fig.S4、Fig.S5，补充表Table S3E。研究意义：证实了单一鞭毛基因簇的敲除不会对菌株葡萄糖产粘康酸的性能产生负面影响，明确了EM42的性能缺陷是多个基因组区域删除的综合效应，而非单一鞭毛缺失导致。
⑩ 芳香族化合物为唯一碳源的菌株生长动力学数据：包含8种芳香族底物不同浓度下，KT2440与EM42菌株的比生长速率、最大OD600、生长延滞期数据，数据来自Fig.6，补充图Fig.S6，补充表Table S3F、S3G。研究意义：首次系统解析了EM42菌株在芳香族化合物为唯一碳源时的生长特征，发现其生长延滞期更短但比生长速率更低，揭示了其以芳香族化合物为底物时生产性能下降的生理基础，填补了EM42芳香族代谢表型的研究空白。
⑪ 不同葡萄糖浓度下菌株的生长动力学数据：包含10 mM和30 mM葡萄糖下，CJ781与CJ921、GB062与CA055菌株的生长曲线、最大OD600、生长速率数据，数据来自补充图Fig.S7，补充表Table S3H。研究意义：明确了EM42衍生菌株仅在低葡萄糖浓度下具有生长优势，高葡萄糖浓度下该优势完全消失，揭示了其葡萄糖利用的浓度依赖性特征，为发酵工艺的底物浓度优化提供了直接参考。
⑫ 菌株转录组学与差异表达分析数据：包含EM42与KT2440在对香豆酸底物下的差异表达基因、CA055与GB062在不同葡萄糖浓度下的差异表达基因、两株菌对葡萄糖浓度变化的响应基因数量与功能注释数据，数据来自Fig.7，补充图Fig.S8、Fig.S9，补充表Table S3I-M。研究意义：从转录水平揭示了基因组精简对EM42菌株全局基因表达的影响，发现其对葡萄糖浓度变化的基因表达调控响应能力显著丧失，阐明了两株菌生产性能差异的核心分子机制，为后续EM42底盘的调控网络重构提供了精准靶点。
8.研究结论
① 基因组精简的EM42衍生菌株，在以对香豆酸或葡萄糖为底物生产顺,顺-粘康酸时，无论是摇瓶培养还是工业化补料分批发酵，综合生产性能均未优于等基因的KT2440衍生菌株；其中KT2440菌株以对香豆酸为底物的粘康酸最高滴度达45 g/L，EM42菌株为37 g/L；以葡萄糖为底物时，KT2440菌株最高滴度达20 g/L，EM42菌株仅为13 g/L。
② EM42菌株以芳香族化合物为唯一碳源时，展现出更短的生长延滞期，但绝大多数芳香族底物下的比生长速率显著低于KT2440菌株；仅在10 mM的低浓度葡萄糖下，EM42衍生菌株具有生长优势，葡萄糖浓度升高至30 mM后，该优势完全消失，这是其高底物负荷下生产性能下降的重要生理原因。
③ EM42中随鞭毛基因簇一同缺失的fabH1基因，以及单一鞭毛基因簇的敲除，并非导致其粘康酸生产性能下降的原因，菌株的性能缺陷是基因组中多个区域删除带来的综合多效性效应。
④ 基因组精简对EM42菌株的全局基因表达产生了显著的非预期影响，不仅导致大量基因的表达水平全局性下调，还使其丧失了对葡萄糖浓度变化的动态基因表达调控响应能力，这是其以葡萄糖为底物时生产性能下降的核心分子机制。
⑤ 基因组精简策略并非能普适性提升微生物底盘的生产性能，其效果具有强烈的场景依赖性；在将EM42或其他基因组精简菌株作为代谢工程底盘时，必须在目标产物、目标底物的实际应用场景下，与野生型亲本菌株开展直接的头对头对比，才能实现底盘菌株的理性选择。
⑥ EM42菌株更短的生长延滞期、低葡萄糖浓度下的生长优势、更高的NADPH供应能力，使其在特定场景下（如NADPH受限的合成途径、低底物浓度的连续发酵、需要快速启动代谢的工艺）仍具备潜在的应用价值。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义详细解读
本研究使用的是芬兰Growth Curves公司研发的Bioscreen C Pro全自动微生物生长曲线分析仪，该仪器是微生物生长动力学研究的金标准设备，可实现高通量、全自动、无干扰的细菌生长动态连续监测。本研究借助该仪器完成了恶臭假单胞菌KT2440与EM42菌株在8种芳香族化合物、不同浓度葡萄糖为唯一碳源时的生长曲线测定，获得了生长延滞期、比生长速率、最大生物量等核心生长动力学参数，其研究意义可分为以下七大层面：
第一，为菌株芳香族代谢能力的系统解析提供了高通量、高重复性的定量数据，填补了EM42菌株芳香族代谢表型的研究空白。芳香族化合物是木质纤维素生物质的核心组分，也是恶臭假单胞菌作为木质素生物炼制底盘的核心底物，而过往研究仅关注了EM42在葡萄糖等单糖底物下的生长表型，未系统评估其芳香族化合物利用能力。Bioscreen仪器可同时完成上百个样本的平行培养与全自动OD值高频连续监测，本研究中实现了8种芳香族底物、3个浓度梯度、3个生物学重复的同步培养与生长曲线测定，彻底消除了手动取样、分批培养带来的系统误差，获得了高重复性的比生长速率、最大生物量数据，首次明确了EM42菌株在绝大多数芳香族底物下的比生长速率显著低于KT2440，这一核心发现直接解释了其以对香豆酸为底物时粘康酸生产性能下降的生理基础。
第二，精准界定了EM42菌株生长优势的适用浓度边界，为其底盘应用的场景选择提供了定量依据。过往研究报道EM42在葡萄糖底物下具有生长速率、生物量得率的优势，但未探究葡萄糖浓度对该优势的影响。Bioscreen仪器的高灵敏度检测能力，可精准捕捉低浓度底物下菌株的细微生长差异，本研究通过该仪器对比了10 mM和30 mM葡萄糖下菌株的生长动力学，首次发现EM42的生长优势仅存在于10 mM的低葡萄糖浓度下，当葡萄糖浓度升高至30 mM时，其生长速率与最大生物量优势完全消失，甚至出现生长滞后。这一发现不仅解释了EM42衍生菌株在高葡萄糖浓度的补料分批发酵中生产性能下降的原因，更精准界定了EM42底盘的适用浓度边界，为其在不同发酵工艺中的应用提供了直接的定量参考。
第三，为两株菌的生长表型差异提供了全维度的定量参数，排除了“生产性能差异源于基础生长能力”的干扰。本研究中，EM42与KT2440衍生菌株的粘康酸生产性能差异，可能源于菌株本身的基础生长繁殖能力差异，而非代谢工程途径的效率差异。Bioscreen仪器可连续、无干扰地监测菌株的完整生长周期，获得生长延滞期、指数生长期比生长速率、稳定期最大生物量、代时等全维度生长动力学参数，本研究通过这些参数明确了：EM42的核心生长特征是“延滞期更短，但指数期生长速率更低”，而KT2440则是“延滞期稍长，但指数期生长更快、高底物浓度下生物量积累能力更强”。这一结论证实了两株菌的生产性能差异并非源于基础生长能力的缺陷，而是底物代谢效率、全局调控能力的差异，为后续转录组学的机制解析指明了方向，保证了研究结论的逻辑严谨性。
第四，为整个研究的所有生物学实验提供了标准化的菌体制备与生长状态参照，保证了所有实验的平行性与可重复性。本研究涉及摇瓶发酵、生物反应器培养、转录组学取样、基因回补验证等大量平行实验，而细菌的初始生长状态、取样时期会直接影响实验结果的稳定性与可比性。Bioscreen仪器绘制的标准生长曲线，可精准确定每一株菌的延滞期、对数生长期中期、稳定期的具体时间节点与对应OD600值，为所有实验提供了标准化的菌体接种浓度、取样时间点，确保了转录组学取样时所有菌株均处于完全一致的对数生长期中期，彻底消除了生长时期差异带来的基因表达差异干扰，大幅提升了转录组学数据的可靠性，也保证了整个研究所有实验数据的平行性、可重复性与结论的严谨性。
第五，为关键基因的功能验证提供了高通量的表型筛选方法，大幅提升了实验效率。本研究中针对fabH1基因的回补、鞭毛基因簇的单独敲除，需要快速、平行地验证基因操作对菌株生长表型的影响。Bioscreen仪器的高通量特性，可同时完成野生型、基因敲除株、回补株的多底物、多重复生长曲线测定，在短时间内获得大量菌株的生长动力学数据，高效验证了fabH1基因的回补并未显著改变EM42菌株在芳香族底物和葡萄糖下的生长表型，单一鞭毛基因簇的敲除也未影响KT2440菌株的生长与生产性能，快速排除了这些基因操作对菌株表型的干扰，大幅提升了基因功能验证实验的效率与通量。
第六，为后续菌株的代谢工程改造与发酵工艺优化提供了基础的生长动力学数据库。本研究通过Bioscreen仪器获得的KT2440与EM42在不同芳香族底物、不同葡萄糖浓度下的全维度生长动力学参数，构建了两株菌的底物利用生长特征数据库。该数据库不仅为当前研究的机制解析提供了数据支撑，更为后续针对两种底盘的代谢工程改造提供了关键参考：比如针对EM42芳香族底物生长速率低的缺陷，可定向强化芳香族分解代谢途径的表达；针对其低葡萄糖浓度的生长优势，可开发连续流加、低底物浓度维持的发酵工艺，最大化发挥其底盘优势。
第七，为微生物基因组精简底盘的性能评估建立了标准化的生长表型分析范式。基因组精简是合成生物学底盘构建的核心策略之一，而底盘菌株的生长动力学特征是评估其性能的核心基础指标。本研究中利用Bioscreen仪器的高通量、全自动、高重复性特性，建立了一套“多底物、多浓度、多重复”的微生物底盘生长表型系统评估方法，该方法可快速、全面地解析基因组精简对菌株底物利用、生长动力学的影响，为其他微生物基因组精简底盘的性能评估、适用性边界界定提供了可复制、标准化的研究范式，对合成生物学底盘菌株的理性设计与评估具有重要的方法学参考价值。