Chemical composition, antioxidant potential, and antibacterial mechanism of Bischofia javanica ethanol extract against Staphylococcus aureus
重阳木乙醇提取物的化学成分、抗氧化能力及对金黄色葡萄球菌的抑菌机制
来源：LWT - Food Science and Technology 222 (2025) 117682
1.论文摘要核心内容
本研究系统探究了重阳木（Bischofia javanica Blume）乙醇提取物（BJBE）的化学成分、抗氧化特性及对金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制。通过UPLC-ESI-MS分析，共鉴定出10种化合物，包括2种甾醇、6种黄酮醇和2种酚酸，其中β-谷甾醇、山奈酚、没食子酸为提取物中的主要成分。ABTS和DPPH自由基清除实验结果显示，BJBE具有强抗氧化活性；其对金黄色葡萄球菌的生长呈浓度依赖性抑制，最低抑菌浓度（MIC）为2.60 mg/mL。研究明确其抑菌机制主要包括：降低细菌胞内ATP水平、引起细胞膜去极化、诱导胞质内容物渗漏、降低细菌胞内蛋白含量、抑制生物被膜形成及损伤细菌细胞膜。上述结果表明，BJBE作为天然食品防腐剂或杀菌剂，在食品加工与处理环节中，可有效应对金黄色葡萄球菌引发的食品安全问题，具备良好的应用潜力。
2.关键词（中文）
重阳木提取物、化学成分、抗氧化能力、金黄色葡萄球菌、抑菌活性、作用机制
3.研究目的
① 针对食品工业中金黄色葡萄球菌污染引发的食源性疾病、食品安全风险，以及抗生素耐药性蔓延、化学合成防腐剂的安全隐患等行业痛点，挖掘天然植物源抑菌剂，系统解析重阳木乙醇提取物的化学成分组成，首次完成其中特征活性物质的定性与定量分析；
② 系统评价BJBE的体外抗氧化能力，明确其自由基清除活性的剂量-效应关系，量化其抗氧化活性强度；
③ 测定BJBE对金黄色葡萄球菌的抑菌活性，确定最低抑菌浓度，从细胞壁完整性、细胞膜功能、能量代谢、生物被膜形成等多个维度，系统揭示其对金黄色葡萄球菌的抑菌作用分子机制；
④ 填补重阳木提取物对金黄色葡萄球菌抑菌机制的研究空白，为其作为天然食品防腐剂、抑菌剂在食品工业中的开发应用提供全面的理论依据和实验数据支撑。
4.研究思路
本研究以药食同源植物重阳木为研究对象，以其对食源性致病菌金黄色葡萄球菌的抑菌活性与作用机制为核心目标，按以下逻辑开展系统性研究：
第一步，采集海南保亭的重阳木鲜叶，经清洗、干燥、粉碎后，采用80%乙醇超声提取，经真空抽滤、旋转蒸发浓缩制备BJBE冻干粉，通过两套UPLC-MS/MS系统对提取物中的化学成分进行分离、定性鉴定与绝对定量，明确其活性物质组成与含量分布；
第二步，采用ABTS和DPPH两种经典自由基清除实验，设置0.125~4 mg/mL的浓度梯度，评价BJBE的体外抗氧化活性，计算半数抑制浓度IC50，明确其抗氧化能力的剂量效应关系；
第三步，采用微量肉汤稀释法测定BJBE对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC），并通过芬兰Bioscreen C PRO全自动生长曲线分析仪，测定0.25、0.5、1 MIC浓度下BJBE对金黄色葡萄球菌24h内的生长动态影响，验证其浓度依赖性抑菌活性；
第四步，多维度系统解析抑菌作用机制：① 检测胞外碱性磷酸酶（AKP）活性，评估BJBE对细菌细胞壁完整性的损伤作用；② 测定胞外蛋白含量、胞内ATP水平、细胞膜电位变化，结合激光共聚焦显微镜（CLSM）活死染色观察，明确BJBE对细菌细胞膜完整性、通透性及能量代谢的影响；③ 采用结晶紫染色法，测定不同浓度BJBE对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制效果；④ 通过场发射扫描电镜（FEGSEM）直观观察BJBE处理后金黄色葡萄球菌的形态学与超微结构变化；
第五步，整合化学成分、抗氧化活性、抑菌活性与机制研究数据，综合评价BJBE作为天然食品防腐剂的应用潜力，为其后续开发与产业化应用提供完整的理论支撑。
5.研究亮点
① 首次通过UPLC-ESI-MS系统解析并定量了重阳木乙醇提取物的化学成分，共鉴定出10种生物活性化合物，其中山奈酚、没食子酸、绿原酸、橙皮素、芦丁为首次在重阳木中被定量检测，明确了β-谷甾醇、山奈酚、没食子酸为其核心活性物质，填补了该植物化学成分定量研究的空白；
② 首次系统揭示了重阳木乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的多靶点协同抑菌机制，明确其通过“破坏细胞壁完整性-损伤细胞膜结构与功能-扰乱细菌能量代谢-抑制生物被膜形成”的级联效应发挥杀菌作用，突破了此前仅报道其抑菌活性、未解析作用机制的研究局限；
③ 证实BJBE兼具强抗氧化活性与高效抑菌活性，其对金黄色葡萄球菌的MIC为2.60 mg/mL，抑菌效果显著优于蒲公英、虎杖等多数常见植物源提取物，同时核心活性物质具备明确的抑菌、抗氧化功效，为其多功能食品添加剂开发奠定了基础；
④ 首次发现BJBE能显著抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，且在0.5 MIC的亚抑菌浓度下即表现出显著抑制效果，为解决金黄色葡萄球菌生物被膜导致的消毒剂抗性、食品持续污染等行业痛点提供了新的天然解决方案；
⑤ 研究对象为亚洲多国传统使用的药食同源植物重阳木，具备天然的食用安全性与热带、亚热带地区广泛分布的资源易得性，为开发安全、高效的天然食品防腐剂替代化学合成防腐剂提供了优质候选材料，契合食品行业对天然、清洁标签添加剂的发展需求。
6.可延伸的方向
① 开展BJBE在不同食品基质（果蔬汁、乳制品、肉制品、烘焙食品、罐头食品等）中的实际抑菌效果验证，优化其在食品中的添加剂量、施用方式与储存条件，建立适配不同食品品类的工业化应用标准化方案；
② 对BJBE中的核心活性单体（β-谷甾醇、山奈酚、没食子酸）进行分离纯化，分别测定各单体的抑菌、抗氧化活性，明确各单体的协同抑菌效应，筛选出核心功效单体并开展结构修饰与活性优化；
③ 开展BJBE的毒理学安全性系统评价，包括急性毒性、亚慢性毒性、遗传毒性等动物体内实验，完成食品添加剂申报相关的安全性数据积累，为其商业化应用与法规审批提供核心支撑；
④ 探究BJBE与食品非热加工技术（超高压、超声波、低温等离子体等）、其他天然抑菌剂（植物精油、细菌素、乳酸菌发酵产物等）的协同抑菌效应，开发复合天然抑菌制剂，拓宽抑菌谱、降低使用剂量、提升食品防腐保鲜效果；
⑤ 结合转录组、蛋白质组学技术，深入解析BJBE对金黄色葡萄球菌的抑菌分子机制，筛选其作用的关键靶点基因与蛋白，明确其对细菌群体感应、毒力因子表达、核心代谢通路的调控作用；
⑥ 评估BJBE对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等耐药菌株的抑菌活性，研究其长期使用是否会诱导细菌产生耐药性，拓展其在耐药食源性致病菌防控中的应用场景；
⑦ 优化BJBE的提取制备工艺，通过响应面法、酶解辅助提取等技术提升活性物质得率，开发微胶囊包埋、纳米递送等制剂技术，提升其在食品基质中的稳定性与生物利用度；
⑧ 开展BJBE在食品生产环境中的消杀应用研究，评估其对食品生产线、设备表面金黄色葡萄球菌成熟生物被膜的清除效果，实现从食品原料、加工过程到终端产品的全链条食品安全防控。
7.测量的数据、研究意义及对应图表
① 重阳木乙醇提取物的化学成分定性与定量数据：通过两套UPLC-MS系统鉴定出10种化合物，包括2种酚酸、6种黄酮醇、2种甾醇，并测定了各化合物在提取物中的干重含量，数据来自Table 1、Table 2，对应色谱图为Fig.S1、Fig.S2。研究意义：首次系统解析并定量了BJBE的活性物质组成，明确了β-谷甾醇、山奈酚、没食子酸为核心功效成分，为其抗氧化、抑菌活性的物质基础解析提供了核心数据，同时填补了重阳木化学成分定量研究的空白。
② BJBE的体外抗氧化活性数据：测定了0.125~4 mg/mL浓度下BJBE的ABTS和DPPH自由基清除率，计算得到ABTS自由基清除的IC50为85 μg/mL，DPPH自由基清除的IC50为127 μg/mL，数据来自Fig.1。研究意义：明确了BJBE具有显著的体外抗氧化活性，且活性呈浓度依赖性，证实其可作为天然抗氧化剂应用于食品中，同时为其抑菌活性的协同作用提供了辅助依据。
③ BJBE对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）数据：通过微量肉汤稀释法测定，明确BJBE对金黄色葡萄球菌的MIC为2.60 mg/mL。研究意义：量化了BJBE的抑菌活性强度，证实其对金黄色葡萄球菌具有高效的生长抑制作用，为后续抑菌机制研究的浓度设置提供了核心基准，也为食品应用中的剂量选择提供了基础数据。
④ BJBE对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响数据：通过Bioscreen C PRO测定了0、0.25、0.5、1 MIC浓度下，24h内金黄色葡萄球菌的OD600nm动态变化，绘制了细菌生长曲线，数据来自Fig.2。研究意义：动态验证了BJBE对金黄色葡萄球菌的浓度依赖性抑菌活性，证实1 MIC浓度下可完全抑制细菌生长，0.5 MIC可显著抑制生长，直观呈现了BJBE的抑菌时效与量效关系，为其抑菌活性提供了直接的动态证据。
⑤ BJBE对金黄色葡萄球菌胞外AKP酶活性的影响数据：测定了0、1、2、4 MIC浓度下，处理0、3、6、9h后胞外AKP酶的活性变化，数据来自Fig.3。研究意义：AKP是定位于细菌细胞壁与细胞膜之间的特征酶，胞外AKP活性升高直接证实了BJBE可破坏金黄色葡萄球菌的细胞壁完整性，揭示了其抑菌作用的第一道作用靶点，为细胞壁损伤机制提供了直接的生化证据。
⑥ BJBE对金黄色葡萄球菌胞外蛋白含量的影响数据：测定了0、1、2、4 MIC浓度下，处理1~6h后胞外上清中的蛋白含量变化，数据来自Fig.4。研究意义：胞内蛋白的渗漏是细菌细胞膜完整性受损的核心标志，该数据证实了BJBE可呈浓度、时间依赖性地破坏细菌细胞膜，导致胞内蛋白大量外泄，明确了其对细胞膜的损伤作用，是抑菌机制的核心生化证据之一。
⑦ BJBE对金黄色葡萄球菌胞内ATP浓度的影响数据：测定了0、1、2、4 MIC浓度处理30min后，细菌胞内的ATP含量变化，数据来自Fig.5。研究意义：ATP是细菌细胞的核心能量物质，胞内ATP水平骤降证实了BJBE可通过破坏细胞膜通透性导致ATP外泄，同时抑制细菌的能量代谢，从能量代谢维度揭示了其抑菌机制，解释了细菌生长停滞的核心原因。
⑧ BJBE对金黄色葡萄球菌细胞膜电位的影响数据：通过DiBAC4(3)电压敏感荧光探针，测定了0、0.5、1、2、4 MIC浓度处理后细菌的荧光强度变化，评估细胞膜去极化程度，数据来自Fig.6。研究意义：细胞膜电位是细菌生理稳态的核心指标，该数据证实了BJBE可引起细菌细胞膜显著去极化，破坏细胞膜的电化学梯度，进一步明确了其对细胞膜功能的损伤，完善了细胞膜相关的抑菌机制解析。
⑨ BJBE对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制数据：通过结晶紫染色法，测定了0、0.25、0.5、1、2 MIC浓度下，BJBE对细菌生物被膜形成的抑制效果，数据来自Fig.7。研究意义：首次证实BJBE可浓度依赖性地抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，0.5 MIC即表现出显著抑制效果，解决了生物被膜导致的细菌耐药性与食品污染难清除的行业痛点，为其在食品生物被膜防控中的应用提供了关键数据。
⑩ BJBE对金黄色葡萄球菌细胞膜完整性与细胞活性的影响数据：通过SYTO9/PI荧光染色结合激光共聚焦显微镜（CLSM），观察了0、1、4 MIC浓度处理后细菌的活死细胞比例与细胞膜完整性，数据来自Fig.8。研究意义：直观可视化地证实了BJBE可浓度依赖性地损伤细菌细胞膜，导致细菌死亡，从细胞活性层面直接验证了其杀菌效果，为细胞膜损伤机制提供了直观的影像学证据。
⑪ BJBE对金黄色葡萄球菌形态与超微结构的影响数据：通过场发射扫描电镜（FEGSEM），观察了0、1、4 MIC浓度处理后细菌的形态与超微结构变化，数据来自Fig.9。研究意义：从超微结构层面直观证实了BJBE可导致细菌皱缩、表面凹陷、细胞膜穿孔、胞质外泄，直接呈现了细菌细胞壁与细胞膜的损伤表型，为其抑菌机制提供了最直观的形态学证据，与生化实验结果形成了完整的相互验证。
8.研究结论
① 本研究通过UPLC-MS技术，首次在重阳木中鉴定并定量了10种生物活性化合物，包括2种甾醇、6种黄酮醇和2种酚酸，其中β-谷甾醇为最主要成分（占比70%），其次为山奈酚和没食子酸，明确了重阳木是天然生物活性物质的优质来源，填补了其化学成分定量研究的空白；
② 重阳木乙醇提取物（BJBE）在ABTS和DPPH自由基清除实验中表现出显著的抗氧化活性，ABTS自由基清除IC50为85 μg/mL，DPPH自由基清除IC50为127 μg/mL，具备作为天然抗氧化剂的良好应用潜力；
③ BJBE对金黄色葡萄球菌具有显著的浓度依赖性抑菌活性，最低抑菌浓度（MIC）为2.60 mg/mL，1 MIC浓度下可完全抑制金黄色葡萄球菌的生长，0.5 MIC可显著阻断细菌的指数增殖；
④ BJBE对金黄色葡萄球菌的抑菌机制为多靶点协同作用，主要包括：破坏细菌细胞壁完整性，导致AKP酶外泄；损伤细菌细胞膜结构，引起细胞膜去极化、通透性增加，造成胞内蛋白、ATP大量外泄，扰乱细菌能量代谢与生理稳态；显著抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成；最终导致细菌结构破坏、代谢紊乱而死亡；
⑤ 重阳木为传统药食同源植物，其乙醇提取物未检出有毒有害物质，具备天然的食用安全性，兼具优异的抗氧化与抑菌活性，作用机制明确，可作为天然食品防腐剂、抑菌剂在食品与制药行业中开发应用；后续可通过体内安全性评价与食品基质应用试验，进一步推进其产业化落地。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义详细解读
本研究中使用的是芬兰Yo AB Ltd.（Growth Curves）公司研发的Bioscreen C PRO全自动微生物生长曲线分析仪，该仪器是微生物生长动力学、抑菌活性评价的金标准设备，可实现高通量、全自动、无干扰的实时动态监测，能精准、连续记录微生物培养体系中600nm波长的光密度（OD）值，完整呈现微生物从延滞期、指数期到稳定期的全生长周期动态，是植物源提取物抑菌活性评价的核心标准化设备。本研究中该仪器测得的金黄色葡萄球菌生长曲线数据（对应Fig.2），核心研究意义分为以下层面：
第一，动态、直观地验证了BJBE对金黄色葡萄球菌的浓度依赖性抑菌活性，明确了抑菌作用的时效与量效关系。通过Bioscreen C PRO仪器连续24h、每2h一次的OD600nm实时监测，完整绘制了0 MIC（空白对照）、0.25 MIC、0.5 MIC、1 MIC共4个浓度梯度下金黄色葡萄球菌的生长曲线。数据清晰显示，空白对照组的金黄色葡萄球菌经历2h延滞期后，4~10h进入快速指数生长期，10h后进入稳定期，呈现典型的细菌生长周期；而0.25 MIC处理组的细菌生长速率显著降低，增殖受到明显抑制；0.5 MIC处理组的细菌生长被大幅抑制，仅在4h出现轻微的OD值上升；1 MIC处理组的OD值在整个24h监测期内始终维持在基线水平，完全抑制了金黄色葡萄球菌的生长。这一动态数据，直观、定量地证实了BJBE的抑菌活性随浓度升高而增强，呈现显著的浓度依赖性，为其抑菌活性提供了最直接、最核心的动态实验证据，同时明确了不同浓度下的抑菌时效，为食品应用中“即时抑菌”和“长效保鲜”的不同需求提供了精准的剂量选择依据。
第二，排除了静态终点法的检测偏差，为BJBE的抑菌活性提供了标准化、高重复性的定量证据。传统的抑菌活性检测多采用终点法，仅测定24h培养后的OD值或菌落数，无法捕捉细菌生长过程中的动态变化，易出现检测偏差；而Bioscreen C PRO的全自动连续监测模式，避免了手动取样的操作误差、污染风险和时间断点，完整捕捉到了BJBE对细菌延滞期、指数生长期的全程影响，精准区分了“完全抑菌”和“部分抑制”的不同效果。同时，该仪器是全球食品微生物、天然抑菌剂研究领域公认的标准化设备，其测得的数据具有极高的重复性、可靠性和行业通用性，可与全球范围内其他植物源抑菌剂、食品防腐剂的研究数据进行横向对比，大幅提升了本研究结果的行业认可度与可重复性，为后续其他研究团队的验证、以及该提取物的商业化开发、行业标准制定提供了标准化的核心数据。
第三，为后续抑菌机制研究的浓度选择与实验设计提供了关键的基础依据。Bioscreen C PRO测得的生长曲线数据，明确了BJBE对金黄色葡萄球菌的抑菌临界浓度：1 MIC为完全抑菌浓度，0.5 MIC为显著抑制浓度，0.25 MIC为部分抑制浓度。基于这一结果，后续的AKP酶活性、胞外蛋白含量、胞内ATP水平、细胞膜电位、生物被膜抑制、显微观察等机制研究，均设置了0.25~4 MIC的浓度梯度，确保了机制研究的浓度设置与抑菌活性直接匹配，能够精准揭示不同抑菌效果对应的分子机制。例如，1 MIC浓度下的完全抑菌对应细胞壁、细胞膜的严重损伤，0.5 MIC浓度下的部分抑菌对应生物被膜的显著抑制，实现了抑菌表型与作用机制的精准对应，保证了机制研究结果的科学性与相关性。
第四，与其他抑菌机制实验数据形成完美互补，完整闭环了BJBE的抑菌活性与作用机制评价体系。Bioscreen C PRO测得的生长曲线，反映的是BJBE对金黄色葡萄球菌群体生长的整体表型影响；而后续的AKP酶、胞外蛋白、ATP水平、膜电位、显微观察等实验，则分别从细胞壁、细胞膜、能量代谢、超微结构等维度，揭示了表型背后的内在机制。生长曲线的表型数据，为机制研究提供了“果”，而机制研究则解释了生长抑制的“因”，二者相互印证、互为补充，完整构建了“抑菌表型-作用机制”的完整研究体系。例如，生长曲线显示1 MIC可完全抑制细菌生长，而CLSM和FEGSEM观察则证实该浓度下细菌细胞膜严重破损、细胞死亡，生化实验则证实了胞内ATP、蛋白大量外泄，从表型到机制形成了完整的证据链，大幅提升了研究结论的科学性与说服力。
第五，为BJBE在食品工业中的实际应用提供了直接的体外活性前提。食品基质中的蛋白质、脂肪、糖类、pH、离子强度等复杂因素，会对植物提取物的抑菌活性产生显著影响；而LB液体培养基中的生长抑制曲线，是排除这些复杂干扰后，BJBE本身固有的抑菌活性的最直接、最纯粹的体现。Bioscreen C PRO测得的数据，先在纯培养体系中证实了BJBE对食品来源金黄色葡萄球菌的高效抑制能力，证明其具备食品生物防控的核心潜力，为后续在果汁、乳制品、肉制品等实际食品基质中的应用试验提供了必要的前提和理论基础，是该提取物从实验室基础研究到食品工业化应用转化的关键环节数据。