The fruB Gene of Streptococcus mutans Encodes an Endo-Levanase That Enhances Growth on Levan and Influences Global Gene Expression
变形链球菌fruB基因编码一种可增强左聚糖利用能力并调控全局基因表达的内切左聚糖酶
来源：spectrum May/June 2022 Volume 10 Issue 3 10.1128/spectrum.00522-22
1.论文摘要核心内容
变形链球菌是人类龋齿的主要致病菌，其与多种口腔链球菌、放线菌均可合成果糖同聚物果聚糖，主要分为β2,1-连接的菊粉型与β2,6-连接的左聚糖型，该菌降解果聚糖的能力直接影响龋齿的发生严重程度。已知变形链球菌fruA基因编码胞外外切β-D-呋喃果糖苷酶，可从左聚糖和菊粉中水解释放果糖；而位于fruA下游70 bp处的fruB基因，虽被预测编码糖苷水解酶32家族蛋白，但其生物学功能始终未被明确。本研究通过变形链球菌野生型UA159菌株与fruB缺陷株的生长实验发现，fruB突变株在以左聚糖为唯一碳源时生长速率显著下降，而以菊粉为唯一碳源时无生长表型差异。纯化的重组FruB蛋白可降解左聚糖，主要产物为低聚果糖。fruB基因的转录由fruA启动子和fruA编码序列3'端的次级启动子共同驱动，可被果糖、尤其是左聚糖诱导表达，而两基因间区的稳定茎环结构可调控fruA到fruB的转录通读效率。对左聚糖培养的野生型与fruB突变株进行转录组分析发现，fruB缺失会导致ABC转运蛋白、转录调控因子、生长与胁迫耐受相关基因的表达发生显著改变。FruB增强左聚糖代谢的能力，及其在变形链球菌不同分离株中的高度保守性，表明该基因对变形链球菌在人牙菌斑生物膜中的环境适应性与致龋毒力具有重要贡献。
2.论文关键词（中文，单行呈现）
变形链球菌、fruB、内切左聚糖酶、胞外多糖、果聚糖代谢、左聚糖、转录调控、酶活性、龋齿、生物膜
3.研究目的
明确变形链球菌fruB编码蛋白的生化功能、底物特异性与水解作用模式，填补该基因在果聚糖代谢中功能未知的长期空白；
解析fruB基因的转录调控机制，明确其与fruA的共转录模式、独立转录元件，以及基因间区顺式作用元件的调控功能；
探究FruB对变形链球菌左聚糖利用能力、生长表型的影响，及其在细菌生理代谢中的全局调控作用；
明确FruB在变形链球菌口腔生态适应性、种间竞争与致龋毒力中的核心作用，为龋齿的预防与治疗提供新型潜在靶点与理论依据。
4.研究思路
第一步，菌株构建与生长表型筛选：通过等位基因交换构建变形链球菌UA159的fruA、fruB单敲除株与fruAB双敲除株，分别以左聚糖、菊粉、葡萄糖、果糖为唯一碳源进行培养，通过生长曲线测定明确FruB对不同果聚糖利用的特异性，同时构建回补株验证表型与基因的因果关系；
第二步，FruB的亚细胞定位与生化功能验证：通过生物信息学预测FruB的信号肽，制备重组His标签FruB蛋白与特异性多克隆抗体，结合细胞组分分离与Western blot明确FruB的亚细胞定位；通过还原糖释放实验定量检测FruB的左聚糖水解活性，利用薄层层析（TLC）分析水解产物类型，明确其内切/外切作用模式与底物特异性；
第三步，fruB基因的转录调控机制解析：通过qRT-PCR检测不同碳源培养下fruA与fruB的转录水平，预测两基因间区的RNA二级结构；构建一系列不同启动子、基因间区片段与cat报告基因的融合载体，单拷贝整合到变形链球菌基因组中，通过CAT活性检测，明确fruB的转录启动元件、基因间区茎环结构的调控作用，以及碳源对其表达的诱导效应；
第四步，FruB的全局调控作用解析：以左聚糖为唯一碳源培养野生型与fruB突变株，提取对数生长期菌体的总RNA进行转录组测序（RNA-seq），分析差异表达基因的数量与功能分类，解析FruB缺失对变形链球菌全局基因表达与生理通路的影响；
第五步，结果整合与生物学意义分析：结合生化功能、转录调控与转录组数据，明确FruB在变形链球菌果聚糖代谢、口腔生态适应与致龋性中的核心作用，揭示其进化意义与潜在应用价值。
5.研究亮点
首次明确了变形链球菌fruB基因的生化功能，证实其编码一种分泌型内切左聚糖酶，可特异性水解β2,6-连接的左聚糖，主要产物为低聚果糖，填补了该基因数十年的功能研究空白，颠覆了“FruA是变形链球菌唯一胞外果聚糖水解酶”的传统认知；
揭示了fruAB操纵子的双重转录调控新机制，发现fruB除了与fruA共转录外，还存在位于fruA 3'编码区的左聚糖诱导型次级启动子，同时明确了两基因间区的稳定茎环结构可通过转录衰减作用调控fruB的表达水平，完善了变形链球菌果聚糖代谢的转录调控网络；
阐明了变形链球菌的种间碳源竞争新策略：变形链球菌自身仅合成β2,1-连接的菊粉型果聚糖，而FruB特异性降解的左聚糖主要由口腔共生的唾液链球菌、放线菌产生，fruB在变形链球菌分离株中高度保守，其核心进化意义是赋予该菌利用口腔共生菌合成的胞外多糖作为能量储备的能力，显著提升其在牙菌斑生物膜中的生态竞争力；
首次发现FruB对变形链球菌的全局基因表达具有广泛调控作用，fruB缺失会导致325个基因的表达显著改变，涵盖碳水化合物代谢、氧化胁迫响应、双组分信号转导、群体感应、遗传感受态、细胞分裂等多个关键生理过程，拓展了对果聚糖代谢与细菌致龋毒力调控关联的认知；
建立了“体内生长表型-体外酶活验证-调控机制解析-全局转录分析”的完整研究体系，明确了FruB在变形链球菌左聚糖代谢中的非冗余功能，为龋齿的精准防控提供了全新的分子靶点。
6.可延伸的方向
深入解析FruB的酶学特性，包括酶促反应动力学参数、最适pH/温度、金属离子依赖性，以及对不同分支度、不同分子量左聚糖的底物偏好性，明确其催化结构域与关键活性位点；
探究FruA与FruB在左聚糖降解中的协同/拮抗作用机制，明确二者在不同口腔微环境（pH波动、氧分压、碳源浓度）下的时空表达特征与亚细胞共定位情况，解析其在体内的功能互补关系；
结合口腔多菌种生物膜模型与大鼠龋齿模型，验证fruB缺失对变形链球菌在口腔多菌群环境中的定植能力、生态竞争力与体内致龋毒力的影响，明确其在临床龋齿发生中的实际作用；
解析fruB次级启动子的转录调控因子，明确LevQRST四组分信号系统、碳分解代谢物阻遏（CCR）关键蛋白CcpA对fruB表达的调控机制，完善果聚糖代谢的全局调控网络；
探究FruB降解产生的低聚果糖的转运与利用途径，及其是否作为信号分子调控变形链球菌的群体感应、生物膜形成与胁迫响应，明确其在细菌生理代谢中的非营养功能；
基于FruB的酶学特性与功能，开发靶向抑制FruB的小分子抑制剂、功能多肽或植物源天然产物，评估其在口腔生物膜中抑制变形链球菌致龋性的应用潜力；
对比分析不同口腔链球菌中fruB同源基因的分布、功能与进化特征，揭示果聚糖代谢系统在口腔链球菌生态适应与致病进化中的普遍规律。
7.测量的数据、对应图表及研究意义
变形链球菌野生型与突变株的生长表型数据
测量内容：野生型UA159、ΔfruA、ΔfruB、ΔfruAB菌株在以0.2%左聚糖为唯一碳源的TV培养基中的完整生长曲线、倍增时间、滞后期时长、最终生长产量；各菌株在葡萄糖、果糖、菊粉为唯一碳源培养基中的生长情况；ΔfruB回补株的生长恢复表型；外源添加重组rFruB对各菌株生长的影响
数据来源：Fig 1、补充图S1
研究意义：直接证实fruB缺失会导致变形链球菌在左聚糖为唯一碳源时出现显著生长缺陷，而对菊粉、己糖的利用无影响，明确了FruB在左聚糖代谢中的特异性作用；回补实验与外源蛋白互补实验验证了生长缺陷直接由fruB缺失导致，排除了极性效应的干扰，为FruB的功能鉴定提供了核心的表型证据。
FruB的亚细胞定位检测数据
测量内容：野生型UA159与ΔfruB菌株的培养上清、细胞壁相关蛋白、细胞膜/细胞质组分中FruB蛋白的Western blot检测结果
数据来源：Fig 2、补充图S3
研究意义：证实FruB是分泌型胞外蛋白，与生物信息学预测的N端信号肽结果一致，明确了其作用位点为胞外环境，与FruA的胞外定位相匹配，为其参与胞外果聚糖降解提供了亚细胞定位层面的直接证据。
FruB的左聚糖水解酶活性定量数据
测量内容：不同浓度重组rFruB、rFruA单独及联合作用下，左聚糖降解过程中还原糖释放量随时间的动态变化
数据来源：Fig 3
研究意义：定量证实FruB具有浓度依赖性的左聚糖水解活性，尽管其水解速率低于外切酶FruA；同时发现二者联合作用时可在特定条件下轻微提升水解效率，为FruA与FruB的协同作用提供了初步的生化证据。
FruB水解作用模式的薄层层析分析数据
测量内容：不同浓度rFruB、rFruA单独及联合作用下，左聚糖降解产物在1 h、4 h、24 h时间点的TLC分离结果，明确产物的糖链类型（单糖果糖、低聚果糖）
数据来源：Fig 4
研究意义：核心生化证据证实FruB为内切左聚糖酶，其降解左聚糖的主要产物为低聚果糖，而非FruA产生的果糖单糖；同时发现高浓度FruB可竞争性抑制FruA的外切水解活性，明确了二者作用模式的本质差异，完成了FruB生化功能的核心鉴定。
fruAB操纵子结构与转录水平检测数据
测量内容：fruA与fruB的基因座结构、70 bp基因间区的RNA二级结构预测（自由能ΔG=-21.24 Kcal/mol）；不同碳源（BHI、葡萄糖、果糖、左聚糖）培养下fruA与fruB的mRNA相对表达水平
数据来源：Fig 5
研究意义：明确了fruAB双基因操纵子的结构特征，预测了基因间区的稳定茎环结构；证实fruB的表达具有碳源依赖性，在左聚糖为碳源时表达量显著上调，而在葡萄糖、果糖中表达量显著低于fruA，为后续转录调控机制解析提供了基础数据。
fruB转录调控的CAT报告基因检测数据
测量内容：7个不同cat融合载体（CAT01-CAT07）在葡萄糖、果糖、左聚糖、菊粉为碳源的培养基中的CAT比活性
数据来源：Fig 6、表2
研究意义：明确了fruB的双重转录驱动机制，除fruA启动子的通读转录外，还存在位于fruA 3'端的左聚糖诱导型次级启动子；同时证实基因间区的茎环结构可作为转录衰减子，显著降低转录通读效率，是调控fruB表达水平的核心顺式作用元件，完整解析了fruB的转录调控机制。
fruB缺失的全局转录组变化数据
测量内容：左聚糖培养的野生型与ΔfruB菌株中，差异表达基因的数量（325个，77个下调、248个上调）、功能分类与具体通路富集情况
数据来源：Fig 7、补充表S1
研究意义：首次揭示FruB除参与左聚糖代谢外，还对变形链球菌全局基因表达具有广泛调控作用，影响了细菌碳水化合物转运与代谢、氧化胁迫响应、双组分信号转导、群体感应、遗传感受态等多个关键生理过程，为理解FruB在细菌环境适应性与致龋性中的作用提供了转录组层面的全局视角。
8.研究核心结论
变形链球菌fruB基因编码一种分泌型糖苷水解酶32家族内切左聚糖酶，可特异性水解β2,6-连接的左聚糖，主要产物为低聚果糖，是该菌中除FruA外第二个功能性胞外果聚糖水解酶；fruB缺失会导致变形链球菌在左聚糖为唯一碳源时滞后期延长、倍增时间增加、最终生长产量下降，而对菊粉、葡萄糖、果糖的利用无影响。
fruB与上游fruA构成双基因操纵子，其转录受双重机制调控：一方面可通过fruA启动子实现共转录，另一方面可通过fruA 3'编码区的左聚糖诱导型次级启动子实现独立转录；两基因间70 bp区域的稳定茎环结构可通过衰减转录通读，显著下调fruB的表达水平，是fruB表达的核心调控元件。
FruB与FruA的水解作用模式存在本质差异：FruA是外切型β-D-呋喃果糖苷酶，可将果聚糖完全降解为果糖单糖；FruB是内切型左聚糖酶，优先水解左聚糖内部的糖苷键产生低聚果糖，高浓度下可与FruA竞争底物结合位点，抑制FruA的外切水解活性。
fruB缺失会导致变形链球菌全局基因表达的显著改变，共325个基因出现差异表达，涵盖ABC转运蛋白、碳水化合物代谢、氧化胁迫响应、双组分信号系统、群体感应、遗传感受态、细胞分裂等多个关键生理通路，表明FruB除参与多糖代谢外，还广泛调控细菌的环境适应性与毒力相关表型。
变形链球菌自身仅合成β2,1-连接的菊粉型果聚糖，而FruB特异性作用的左聚糖主要由口腔共生的唾液链球菌、放线菌产生，且fruB在变形链球菌不同分离株中高度保守，表明该基因的核心进化意义是赋予变形链球菌利用口腔共生菌合成的左聚糖作为碳源的能力，提升其在牙菌斑生物膜中的生态竞争力。
FruB介导的左聚糖代谢不仅为变形链球菌提供了营养储备，还通过调控细菌的胁迫耐受、群体感应等通路影响其在口腔复杂环境中的存活与致病能力，是变形链球菌致龋性的重要调控因子，也是龋齿防控的潜在新型靶点。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪（Oy Growth Curves AB, Helsinki, Finland），对变形链球菌野生型、基因敲除株、回补株在不同碳源培养基中的生长进行了全程实时监测，该仪器获得的生长曲线数据是本研究的核心基础数据，其研究意义可分为以下几个层面：
精准量化菌株生长表型，为FruB的功能鉴定提供核心表型证据
本研究通过Bioscreen C仪器，实现了变形链球菌多组菌株在不同碳源条件下生长的高通量、高重复性实时监测。仪器可自动高频次记录OD600数值，精准绘制完整的细菌生长曲线，量化了各菌株的滞后期时长、指数生长期倍增时间、最终生长产量等关键生长动力学参数，直接证实了fruB缺失仅会导致细菌在左聚糖为唯一碳源时出现显著生长缺陷，而对葡萄糖、果糖、菊粉的利用无影响。这种精准的生长表型量化，是明确FruB在左聚糖代谢中特异性功能的核心表型基础，为后续的酶活验证、调控机制解析提供了明确的生物学表型支撑。
实现多菌株、多条件的平行标准化培养，保障实验结果的严谨性与可比性
本研究需要对比数十个菌株-碳源组合的生长差异，传统手动摇瓶培养、单点OD检测方法，难以实现大量样本的同步培养与生长状态的连续监测，易出现环境条件波动、人为操作误差导致的结果偏差。Bioscreen C仪器的多孔板培养体系，可同时完成数十个样本的平行培养，精准控制37℃恒温、持续恒定的震荡速率，配合矿物油封闭实现变形链球菌最适的微厌氧生长环境，完美模拟了细菌的生理生长条件，消除了环境因素波动对实验结果的干扰。同时，仪器的自动化连续监测避免了手动取样带来的样本污染与检测误差，保障了不同菌株、不同碳源条件下生长数据的平行性、可比性与可重复性，让“FruB特异性调控左聚糖利用”的核心结论更加严谨、可靠。
动态捕捉细菌全周期生长特征，揭示FruB的精细生理功能
与传统终点法生长检测不同，Bioscreen C仪器可实时记录细菌从滞后期、指数生长期到平台期的完整生长动力学过程，能够捕捉到传统方法无法识别的精细表型差异。例如，通过生长曲线的动态监测，研究不仅发现fruB突变株的倍增时间显著延长，还明确了其生长滞后期也明显增加，而外源添加重组FruB蛋白可完全消除这种滞后期差异，直接揭示了FruB在左聚糖利用的初始阶段发挥关键作用。这种全周期的生长动力学监测，完整呈现了FruB对变形链球菌左聚糖利用全过程的调控作用，而非仅反映最终的生长结果，为理解FruB的生理功能提供了更全面、更精细的动力学数据。
建立标准化生长检测体系，支撑全研究流程的功能验证实验
本研究中，Bioscreen C仪器建立的标准化生长检测体系，不仅用于初始的基因功能表型筛选，还为后续的基因回补实验、外源蛋白互补实验提供了统一的实验平台。通过完全一致的培养条件与检测参数，研究验证了fruB回补可部分恢复突变株的生长缺陷，外源添加rFruB可完全消除突变株的生长滞后期，直接证实了生长表型与fruB基因的直接因果关系，排除了极性效应等干扰因素。这种标准化的生长检测体系，保障了不同实验阶段、不同功能验证实验结果的一致性与可追溯性，为整个研究的逻辑链条提供了统一、可靠的实验基础。