Characterization of virulent bacteriophages targeting Bacillus licheniformis: biological properties and genomic functional analysis
靶向地衣芽孢杆菌的烈性噬菌体鉴定：生物学特性与基因组功能分析
来源：Virology 610 (2025) 110619
1.论文摘要核心内容
芽孢杆菌属产孢细菌的生长会严重影响食品品质，给食品生产行业造成巨大经济损失。本研究分离并鉴定了靶向地衣芽孢杆菌的噬菌体，评估其作为食品生物防控制剂的应用潜力。生物学评估结果显示，地衣芽孢杆菌噬菌体KKP_4048和KKP_4049在多种环境条件下具备高稳定性，在-20℃~60℃处理1h、pH 3~11的盐溶液中处理1h均能保持侵染活性，紫外线照射30min后其活性下降99.99%。透射电镜观察结果表明，两株噬菌体均属于尾噬菌体纲，为肌病毒形态型。全自动生长分析仪检测证实，在所有测试的感染复数（MOI）下，两株噬菌体均能显著抑制宿主菌的生长。基因组分析显示，KKP_4048和KKP_4049的基因组为线性双链DNA，全长分别为152106 bp和154029 bp，G+C含量分别为39.01%和38.97%。系统发育分析表明，两株噬菌体与赫勒病毒科Siophivirus属噬菌体亲缘关系最近，且基因组中未检测到溶原相关标记、毒素编码基因及抗生素耐药基因。综上，这两株噬菌体在食品安全生物防控领域具有重要的应用潜力。
2.关键词（中文）
噬菌体（细菌病毒）、地衣芽孢杆菌、尾噬菌体纲、Siophivirus属、基因组学、生物防控
3.研究目的
① 针对食品工业中地衣芽孢杆菌污染导致的食品腐败、安全风险，以及传统消杀手段对芽孢杆菌效果有限的行业痛点，分离获得靶向地衣芽孢杆菌的新型烈性噬菌体，拓展芽孢杆菌噬菌体的种质资源库；
② 对分离的两株噬菌体开展全面的生物学特性鉴定，明确其形态特征、宿主范围、增殖动力学、环境抗逆性，评估其作为生物防控制剂的基础性能；
③ 完成噬菌体全基因组测序、功能注释与比较基因组学分析，精准明确其分类学地位，同时从基因组层面验证其生物安全性，排除溶原性、毒力基因、耐药基因等食品安全风险；
④ 系统验证不同感染复数下噬菌体对宿主菌的生长抑制效果，明确其抑菌活性的量效关系，为其在食品生物防控中的实际应用提供完整的理论依据和数据支撑。
4.研究思路
本研究以食品中常见的腐败菌地衣芽孢杆菌为靶标，以分离新型烈性噬菌体并评估其食品生物防控潜力为核心目标，按以下逻辑开展系统性研究：
第一步，以两株食品来源的地衣芽孢杆菌KKP 3373、KKP 3876为宿主菌，从波兰马佐夫舍地区的土壤样本中分离噬菌体，经3轮单噬斑纯化获得纯培养物，通过双层琼脂平板法测定噬菌体滴度；
第二步，通过透射电子显微镜（TEM）观察噬菌体的噬斑形态与病毒粒子超微结构，完成噬菌体的初步形态学分类；
第三步，采用点滴试验和平板效率（EOP）测定法，以39株不同来源、不同种属的细菌为测试对象，系统评估两株噬菌体的宿主范围与裂解效率；
第四步，通过一步生长曲线试验，测定MOI=0.1条件下噬菌体的潜伏期、上升期和裂解量，明确其侵染增殖动力学特征；
第五步，采用芬兰Bioscreen C Pro全自动生长分析仪，测定MOI 100、10、1.0、0.1、0.01、0.001共6个梯度下，噬菌体对宿主菌24h内的生长抑制效果，验证其体外抑菌活性与量效关系；
第六步，开展环境胁迫耐受性试验，测定不同pH、温度、紫外线照射时长下噬菌体的活性变化，评估其在食品加工、储存场景下的环境稳定性；
第七步，完成噬菌体全基因组纳米孔测序、从头组装与功能注释，结合系统发育分析、全基因组同源性比对，明确噬菌体的分类学地位、基因组结构特征与生物安全性；
最后整合生物学特性与基因组学数据，综合评估两株噬菌体作为食品生物防控制剂的应用潜力与价值。
5.研究亮点
① 首次分离并系统鉴定了两株靶向地衣芽孢杆菌的新型烈性噬菌体KKP_4048和KKP_4049，填补了食品腐败相关地衣芽孢杆菌噬菌体的种质资源空白，为食品中该菌的生物防控提供了全新的候选材料；
② 两株噬菌体具备优异的环境抗逆性，在-20℃~60℃、pH 3~11的宽范围条件下均能保持高侵染活性，可适配食品冷链储存、常温加工、酸性/碱性食品基质等多种应用场景，突破了多数噬菌体环境适应性差的应用瓶颈；
③ 增殖与抑菌性能优异，两株噬菌体仅需15min的极短潜伏期，可快速启动侵染与增殖；在所有测试的MOI梯度下均能完全抑制宿主菌生长，高MOI下可实现对宿主菌的即时生长抑制，低MOI下也能在8h内完成完全裂解，抑菌效率显著；
④ 基因组层面证实了极高的生物安全性，两株噬菌体均为纯烈性噬菌体，基因组中携带完整的holin-endolysin裂解系统，未检出溶原相关基因、毒力因子、毒素编码基因及抗生素耐药基因，完全符合食品级生物制剂的安全要求，规避了溶原性噬菌体带来的食品安全风险；
⑤ 系统完成了噬菌体的比较基因组学与分类学分析，明确其为赫勒病毒科Bastillevirinae亚科Siophivirus属的新成员，丰富了尾噬菌体纲的基因组资源与分类学研究，为该类噬菌体的进化分析提供了新的参考数据。
6.可延伸的研究方向
① 开展噬菌体鸡尾酒制剂研发，将这两株噬菌体与其他芽孢杆菌属噬菌体复配，拓宽宿主谱，提升对食品中多种芽孢杆菌污染的防控效果，降低宿主菌噬菌体抗性的产生风险；
② 验证噬菌体在不同食品基质（果蔬汁、乳制品、肉制品、罐头食品等）中的实际抑菌效果，优化食品中的噬菌体施用剂量、方式和储存条件，建立适配食品工业化生产的标准化应用方案；
③ 探究噬菌体与超高压（HHP）、温和热处理等食品非热加工技术的协同抑菌效应，开发“噬菌体+非热加工”的联合防控技术，实现对芽孢杆菌营养体与孢子的协同灭活，解决芽孢杆菌孢子抗性强的行业痛点；
④ 对噬菌体编码的内溶素、穿孔素等裂解酶进行重组表达与纯化，研究其裂解活性与抑菌谱，开发新型广谱芽孢杆菌裂解酶制剂，拓展其在食品、医药领域的应用场景；
⑤ 开展噬菌体的毒理学安全性评价与食品添加剂申报相关研究，完成动物体内急性毒性、亚慢性毒性试验，为其商业化应用与法规审批提供核心数据支撑；
⑥ 探究噬菌体与地衣芽孢杆菌的互作分子机制，明确噬菌体的受体识别、侵染机制，以及宿主菌的噬菌体抗性产生规律，为噬菌体的理性改造、抗性防控提供理论基础；
⑦ 开展该类噬菌体在养殖端、食品生产环境中的生物消杀应用研究，评估其对食品生产线、设备表面地衣芽孢杆菌生物膜的清除效果，拓展其从源头到终端的全链条防控应用场景。
7.测量的数据、研究意义及对应图表
① 噬菌体噬斑形态与病毒粒子超微结构数据：测定了KKP_4048和KKP_4049的噬斑特征，以及噬菌体头部直径、尾部长度等超微结构参数，数据来自Fig.1（A、C为噬斑形态图，B、D为TEM透射电镜图）。研究意义：明确了两株噬菌体的基本形态特征，证实其均为二十面体头部+可收缩长尾的肌病毒形态型，属于尾噬菌体纲，为噬菌体的初步分类学鉴定提供了核心形态学依据。
② 四株分离噬菌体的全基因组同源性比对数据：测定了KKP_4047、KKP_4048、KKP_4049、KKP_4050四株噬菌体的全基因组相似性、基因组比对覆盖度、长度比例，数据来自Fig.2。研究意义：明确了四株噬菌体的同源性关系，证实KKP_4047与KKP_4048基因完全一致，KKP_4049与KKP_4050相似度达98.2%，为后续选择KKP_4048和KKP_4049作为两个不同物种开展深入分析提供了基因组学依据。
③ 噬菌体全基因组特征与功能注释数据：测定了KKP_4048和KKP_4049的基因组全长、G+C含量、ORF数量、功能基因分类与基因组分布，绘制了基因组圈图，数据来自Fig.3B（KKP_4048）、Fig.4B（KKP_4049）。研究意义：完整解析了两株噬菌体的基因组结构与功能元件，明确了其裂解相关、结构组装、复制代谢、基因组包装相关的功能基因，证实其携带完整的烈性噬菌体裂解系统，为裂解机制解析与基因组安全性分析提供了基础数据。
④ 噬菌体系统发育分析数据：基于全基因组蛋白序列构建了病毒蛋白组发育树，明确了两株噬菌体的分类学地位，数据来自Fig.3A（KKP_4048）、Fig.4A（KKP_4049）。研究意义：从分子进化层面明确了两株噬菌体属于赫勒病毒科Bastillevirinae亚科Siophivirus属，完成了噬菌体的精准分类学鉴定，丰富了该属噬菌体的系统发育研究数据。
⑤ 噬菌体同源序列BLASTn比对数据：测定了KKP_4048、KKP_4049与NCBI数据库中同源噬菌体的基因组长度、G+C含量、核苷酸序列一致性、查询覆盖度、分类地位等信息，数据来自Table 1（KKP_4048）、Table 2（KKP_4049）。研究意义：明确了两株噬菌体与已知同源噬菌体的序列相似性，证实其与Siophivirus属噬菌体SIOphi同源性最高，进一步支撑了分类学结论，同时明确了其作为新型噬菌体的序列特异性。
⑥ 噬菌体全基因组同源性与聚类分析数据：测定了KKP_4048、KKP_4049分别与15株近缘噬菌体的全基因组间相似性、基因组比对比例、长度比，数据来自Fig.5（KKP_4048）、Fig.6（KKP_4049）。研究意义：在全基因组水平定量明确了两株噬菌体与近缘噬菌体的同源性关系，进一步验证了其分类地位，同时为噬菌体物种分界提供了核心的基因组同源性数据。
⑦ 噬菌体AI预测相似性分析数据：通过PhageAI软件预测了两株噬菌体的相似性并绘制2D散点图，数据来自Fig.7。研究意义：从机器学习维度补充验证了噬菌体的分类与生命周期特征，进一步证实其为烈性噬菌体，与基因组分析结果形成互补验证。
⑧ 噬菌体宿主范围与裂解效率数据：测定了两株噬菌体对39株不同来源、不同种属细菌的裂解活性，计算了各敏感菌株的EOP值，数据来自Table 3。研究意义：明确了两株噬菌体的宿主谱特征，证实其对多株食品来源的地衣芽孢杆菌具有高效裂解活性，同时具有严格的宿主特异性，不裂解其他非靶标菌，为其食品应用的靶向性与安全性提供了关键数据。
⑨ 噬菌体一步生长曲线动力学数据：测定了MOI=0.1条件下，两株噬菌体的潜伏期、上升期、裂解量，数据来自Fig.8（A为KKP_4048，B为KKP_4049）。研究意义：明确了两株噬菌体的侵染增殖动力学特征，证实其仅需15min的极短潜伏期，可快速启动侵染与增殖，为其快速裂解宿主菌、实现高效抑菌提供了核心的增殖特性数据。
⑩ 噬菌体对宿主菌的生长抑制曲线数据：通过Bioscreen C Pro测定了不同MOI梯度下，24h内宿主菌的OD400-600nm值动态变化，绘制了生长抑制曲线，数据来自Fig.9（A为KKP_4048，B为KKP_4049）。研究意义：直接验证了两株噬菌体在液体培养体系中对宿主菌的高效抑制效果，明确了MOI与抑菌效率的量效关系，证实其在极低MOI下仍能实现完全抑菌，为其食品应用的剂量选择提供了直接的体外活性依据。
⑪ KKP_4048的环境抗逆性数据：测定了不同pH、温度、紫外线照射时长下KKP_4048的滴度变化，数据来自Fig.10（A为pH稳定性，B为温度稳定性，C为UV照射稳定性）。研究意义：明确了KKP_4048的环境耐受范围，证实其在pH 3~11、-20℃~60℃条件下保持高活性，对短时间UV照射具有一定耐受性，为其在不同食品加工、储存环境中的应用稳定性提供了关键数据。
⑫ KKP_4049的环境抗逆性数据：测定了不同pH、温度、紫外线照射时长下KKP_4049的滴度变化，数据来自Fig.11（A为pH稳定性，B为温度稳定性，C为UV照射稳定性）。研究意义：明确了KKP_4049的环境耐受特征，证实其与KKP_4048具有相近的宽pH、宽温度耐受性，且对UV照射的耐受性更优，60min UV照射仍未完全失活，进一步证实了两株噬菌体在复杂食品环境中的应用潜力。
8.研究结论
① 本研究成功分离并系统鉴定了两株新型地衣芽孢杆菌烈性噬菌体KKP_4048和KKP_4049，经形态学、基因组学与系统发育分析，两株噬菌体均归属于尾噬菌体纲赫勒病毒科Bastillevirinae亚科Siophivirus属，为肌病毒形态型的烈性噬菌体；
② 两株噬菌体具备优异的侵染增殖特性，仅需15min的极短潜伏期，在所有测试的感染复数下均能高效抑制地衣芽孢杆菌宿主菌的生长；高MOI下可实现对宿主菌生长的即时完全抑制，低MOI下也能在8h内完成对宿主菌的完全裂解，具备强效、长效的抑菌活性；
③ 两株噬菌体具有优异的环境抗逆性，在-20℃~60℃处理1h、pH 3~11的条件下均能保持高侵染活性，可适配食品工业中冷链、常温、酸性/碱性基质等多种加工、储存场景的应用需求；
④ 基因组分析证实，两株噬菌体均携带完整的烈性噬菌体裂解相关基因（holin、endolysin等），未检出溶原相关基因、毒力因子、毒素编码基因及抗生素耐药基因，在基因组层面具备食品应用的高生物安全性；
⑤ 综上，噬菌体KKP_4048和KKP_4049是两株安全、高效、环境适应性强的新型地衣芽孢杆菌烈性噬菌体，在食品工业中作为生物防控制剂，防控地衣芽孢杆菌导致的食品腐败与安全风险方面，具有重要的应用潜力。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义详细解读
本研究中使用的是芬兰Yo AB Ltd.公司研发的Bioscreen C Pro全自动微生物生长分析仪，该仪器是微生物生长动力学研究的金标准设备，可实现高通量、全自动、无干扰的实时动态监测，能精准、连续记录微生物培养体系中400-600nm波长的光密度（OD）值，完整呈现微生物从接种到稳定期的全生长周期动态，是噬菌体抑菌活性评价的核心标准化设备。本研究中该仪器测得的生长曲线数据（对应Fig.9A和Fig.9B），核心研究意义分为以下层面：
第一，直接、动态验证了两株噬菌体对宿主地衣芽孢杆菌的高效抑菌活性，明确了抑菌作用的时间动态特征。通过Bioscreen C Pro仪器连续24h、每30min一次的OD值实时监测，完整绘制了6个MOI梯度下噬菌体处理组与未处理对照组的宿主菌生长曲线。数据直观证实，两株噬菌体在所有测试的MOI梯度下，均能完全抑制地衣芽孢杆菌的生长，整个24h观察期内，处理组的OD值始终维持在极低水平，未出现宿主菌的指数生长期，直接、动态地证明了两株噬菌体对靶标宿主菌的强效、长效裂解能力，是其作为生物防控制剂的核心活性证据。同时，仪器的全自动连续监测模式，避免了手动取样的操作误差、污染风险和时间断点，完整捕捉到了噬菌体抑菌作用的起始时间、完全抑制的时长，以及不同MOI下的抑菌动力学差异，为噬菌体的抑菌机制研究提供了高分辨率的动态数据。
第二，精准明确了噬菌体感染复数（MOI）与抑菌效率的量效关系，为食品应用中的最佳施用剂量提供了直接的量化依据。Bioscreen C Pro的高通量检测特性，可同时平行检测多个MOI梯度的10个生物学重复，精准对比了从超高MOI（100）到极低MOI（0.001）的抑菌效果差异。数据明确显示，对于KKP_4048，MOI 100的处理组可实现对宿主菌生长的即时完全抑制；对于KKP_4049，MOI 10的处理组即可实现即时完全抑制；而即使在MOI 0.001的极低剂量下，两株噬菌体也能在8h内实现对宿主菌的完全裂解。这一量效关系数据，直接证明了两株噬菌体在极低剂量下仍具备优异的抑菌效果，大幅降低了其工业化应用的成本；同时为不同食品场景中的噬菌体施用剂量选择提供了精准的量化参考——对于需要即时抑菌的食品加工场景，可选择高MOI剂量；对于需要长期冷链保鲜的食品，低MOI剂量即可实现长效抑菌，为其应用方案的定制化开发提供了核心数据支撑。
第三，为噬菌体的实际食品应用提供了坚实的体外活性前提，排除了复杂食品基质干扰前的核心抑菌能力验证。食品基质中的蛋白质、脂肪、糖类、pH、离子强度等复杂因素，会对噬菌体的抑菌活性产生显著影响，而体外LB液体培养基中的生长抑制曲线，是排除这些复杂干扰后，噬菌体本身固有的抑菌活性的最直接、最纯粹的体现。Bioscreen C Pro测得的生长曲线数据，先在纯培养体系中证实了两株噬菌体对食品来源地衣芽孢杆菌的高效抑制能力，证明其具备食品生物防控的核心潜力，为后续在果汁、乳制品、肉制品等实际食品基质中的应用试验提供了必要的前提和理论基础，是噬菌体从实验室分离到实际应用转化的关键环节数据。
第四，与一步生长曲线数据形成完美互补，完整闭环了噬菌体的侵染-增殖-抑菌全链条特性评价。一步生长曲线（Fig.8）明确了噬菌体单循环侵染的潜伏期、上升期和裂解量，反映的是噬菌体单个侵染周期的增殖动力学特征；而Bioscreen C Pro测得的24h生长抑制曲线，则呈现了噬菌体多循环侵染下，对宿主菌群体生长的长期、持续抑制效果。一步生长曲线证实了两株噬菌体具备极短的潜伏期，可快速完成侵染和子代增殖；而生长抑制曲线则进一步证实，这种快速增殖能力可转化为对宿主菌群体的持续、完全抑制，在24h内不会出现宿主菌的抗性反弹与重新生长，排除了噬菌体处理后宿主菌快速产生抗性的风险。两组数据相互印证、互为补充，完整评价了噬菌体的侵染、增殖、裂解、长期抑菌全链条特性，为其作为长效生物防控制剂提供了全面的生物学特性支撑。
第五，为该噬菌体的抑菌活性评价提供了标准化、行业公认的可对比数据，提升了研究结果的行业认可度与可重复性。Bioscreen系列仪器是全球食品微生物、噬菌体研究领域公认的微生物生长曲线检测金标准设备，其测得的数据具有极高的重复性、可靠性和行业通用性。使用该仪器获得的噬菌体抑菌数据，可与全球范围内其他芽孢杆菌噬菌体、食品生物防控制剂的研究数据进行横向对比，更具行业说服力；同时，标准化的检测方法也保证了实验结果的可重复性，为后续其他研究团队的验证、以及该噬菌体的商业化开发、行业标准制定提供了标准化的核心数据。