Genome-Wide Analysis Reveals that PhoP Regulates Pathogenicity in Riemerella anatipestifer
全基因组分析揭示 PhoP 对鸭疫里默氏菌致病性的调控作用
来源：Microbiology Spectrum September/October 2022 Volume 10 Issue 5 10.1128/spectrum.01883-22
论文整体总结
该论文发表于 2022 年《Microbiology Spectrum》期刊，针对水禽重要致病菌鸭疫里默氏菌的毒力调控机制空白，以 PhoPR 双组分系统为核心研究对象，首次结合 DNA 亲和纯化测序（DAP-seq）与转录组测序（RNA-seq）技术，在全基因组范围内绘制了响应调控因子 PhoP 的直接结合图谱，鉴定了其核心靶基因与保守结合基序。研究通过同源重组构建了 phoP 和 phoR 单基因敲除菌株，解析了两者的转录调控谱差异，揭示了 PhoP 通过直接调控 Bat 操纵子介导菌株氧化应激耐受、进而调控致病性的全新机制，并通过雏鸭感染模型证实 phoP 和 phoR 是该菌的关键毒力决定因子。该研究不仅完善了鸭疫里默氏菌的毒力调控网络，还为其减毒活疫苗开发、新型抗菌药物靶点筛选提供了重要的理论基础与候选材料。
1. 论文摘要内容
鸭传染性浆膜炎又称鸭疫里默氏菌病，可感染家鸭、鹅、火鸡及野生鸟类，但其致病性的调控机制尚不明确。本团队前期研究首次在革兰氏阴性菌中报道了 PhoPR 双组分系统，并证实其参与鸭疫里默氏菌的毒力调控与基因表达。本研究利用 DAP-seq 技术，进一步探究了 PhoPR 对鸭疫里默氏菌致病性的调控机制。研究在 583 个候选靶基因的上游区域鉴定出 PhoP 的保守结合基序，这些基因是 PhoP 的直接调控对象。为进一步明确 PhoR 和 PhoP 调控的基因，研究构建了两个基因的单敲除菌株，RNA-seq 转录组分析显示，ΔphoP 菌株与野生型（WT）之间有 136 个差异表达基因（DEGs），ΔphoR 菌株与 WT 之间有 183 个差异表达基因。结合转录组分析与 DAP-seq 结果，进一步明确了 PhoP 的候选靶基因，发现 PhoP 的核心直接调控子多定位于细胞膜，且 PhoP 参与菌株的耐氧性调控。通过雏鸭体内模型发现，ΔphoP 和 ΔphoR 突变株的致病性显著低于野生型。综上，本研究结果揭示了 PhoP 的直接调控网络，证实 phoPR 是鸭疫里默氏菌致病性的必需基因；所构建的基因敲除菌株有望成为鸭疫里默氏菌的减毒活疫苗候选株，可作为表达外源抗原的理想基因工程载体菌株。
2. 论文关键词
DNA 亲和纯化测序、转录组测序、鸭疫里默氏菌、双组分系统、基因调控、PhoP、毒力
3. 研究目的
全基因组范围内鉴定鸭疫里默氏菌中 PhoP 的直接 DNA 结合位点、靶基因与保守结合基序，绘制其全基因组转录调控图谱，填补该菌 PhoP 直接调控网络的研究空白。
分别构建 phoP 和 phoR 单基因敲除菌株，通过转录组测序解析两者的调控基因谱，明确 PhoP 与 PhoR 在基因表达调控中的共性与差异，完善 PhoPR 双组分系统的作用模式。
整合 DAP-seq 与 RNA-seq 多组学数据，筛选 PhoP 直接转录调控的核心靶基因，揭示其调控鸭疫里默氏菌致病性的分子机制，重点解析其与氧化应激 / 耐氧性调控的关联。
通过雏鸭体内感染模型，系统验证 phoP 和 phoR 基因对鸭疫里默氏菌毒力、体内定殖能力、组织致病性的影响，明确两者作为关键毒力因子的作用。
探索 PhoP 蛋白的 DNA 结合特性，明确磷酸化修饰、蛋白结构域对其 DNA 结合功能的影响，丰富细菌双组分系统的调控机制认知。
评估 phoP/phoR 敲除菌株作为鸭疫里默氏菌减毒活疫苗候选株的潜力，为该菌的疫病防控提供新的材料与思路，同时为新型抗菌药物筛选提供潜在靶点。
4. 研究思路
参考基因组优化：通过 PacBio 三代测序完成鸭疫里默氏菌 RA-YM 菌株的全基因组完成图组装，解决二代测序的重复序列与 GC 偏好性问题，为后续组学分析提供精准的参考基因组。
PhoP 蛋白异源表达与纯化：构建重组表达载体，在大肠杆菌中异源表达 His 标签的 PhoP 全长蛋白与 DNA 结合结构域（DBD），经镍柱纯化后用于后续体外结合实验。
全基因组 PhoP 结合位点鉴定：利用 DAP-seq 技术，体外通过乙酰磷酸模拟 PhoP 磷酸化，与片段化的 RA-YM 基因组 DNA 孵育，富集 PhoP 结合的 DNA 片段并进行高通量测序，分析结合峰、靶基因与保守结合基序；通过凝胶迁移实验（EMSA）验证 PhoP 对靶序列的结合特异性，同时探究磷酸化修饰、结构域对其结合能力的影响。
基因敲除菌株构建：通过同源重组构建 phoP 和 phoR 基因的敲除载体，利用接合转移将载体导入 RA-YM 菌株，经同源双交换筛选获得无痕单基因敲除菌株 ΔphoP 和 ΔphoR，通过 PCR 验证敲除成功。
转录组水平调控谱解析：对野生型 WT、ΔphoP、ΔphoR 菌株进行 RNA-seq 测序，分析差异表达基因的数量、功能与 KEGG 通路富集特征，明确 PhoP 和 PhoR 的全局转录调控谱。
多组学整合与核心靶基因筛选：结合 DAP-seq 的直接结合靶基因与 RNA-seq 的差异表达基因，筛选受 PhoP 直接结合并转录调控的核心靶基因，区分直接调控与间接调控效应，解析其调控网络与潜在的毒力相关通路。
体外表型验证：利用芬兰 Bioscreen C 全自动生长曲线分析仪测定 WT、ΔphoP、ΔphoR 菌株的全周期生长曲线，排除生长缺陷对毒力表型的干扰；通过 H₂O₂胁迫实验验证 PhoP 对菌株氧化应激耐受能力的调控作用。
体内致病性系统验证：通过雏鸭腿部注射感染模型，测定 WT、ΔphoP、ΔphoR 菌株的半数致死量（LD₅₀）；检测感染后 24h、48h 雏鸭血液和组织（肝脏、心脏、脑、脾脏）中的细菌载量；对感染后的组织进行病理切片分析，从多维度验证两个基因对菌株致病性的影响。
机制总结与应用展望：整合多组学、体外生化与体内动物实验结果，阐明 PhoPR 双组分系统调控鸭疫里默氏菌致病性的分子机制，评估敲除菌株作为减毒活疫苗的应用潜力，提出后续研究方向。
5. 研究亮点
首次绘制了鸭疫里默氏菌 PhoP 的全基因组直接调控图谱：利用 DAP-seq 技术在革兰氏阴性菌鸭疫里默氏菌中，全基因组范围内鉴定到 PhoP 的 583 个结合峰、764 个候选靶基因，明确了其核心保守结合基序 TTTAACA，填补了该菌 PhoP 直接调控网络的研究空白，为其毒力调控机制解析奠定了全基因组基础。
揭示了 PhoP 调控致病性的全新分子机制：整合多组学数据筛选出 50 个 PhoP 直接调控的核心靶基因，发现其直接调控子主要定位于细菌细胞膜，首次证实 PhoP 可通过直接正调控 Bat 操纵子，介导菌株的氧化应激 / 耐氧性，进而调控其在宿主内的感染与致病能力，完善了鸭疫里默氏菌的毒力调控网络。
突破了双组分系统的传统认知：体外 EMSA 实验证实，鸭疫里默氏菌 PhoP 的 DNA 结合能力不依赖于体外磷酸化修饰，且其 N 端受体结构域是 DNA 结合功能的必需元件，单独的 C 端 DNA 结合结构域无法完成靶序列结合，丰富了细菌双组分系统响应调控因子的结构 - 功能关系与作用模式认知。
明确了 PhoP 和 PhoR 是鸭疫里默氏菌的关键毒力决定因子：分别构建单基因敲除菌株，结合雏鸭体内模型证实，ΔphoP 和 ΔphoR 菌株的毒力较野生型分别下降 4.72×10⁴倍和 1.06×10⁵倍，体内定殖能力几乎丧失，无法造成宿主组织病理损伤，首次明确了两个基因单独缺失对致病性的影响，且证实 PhoR 对毒力的调控作用更显著。
建立了病原菌双组分系统调控网络解析的标准化技术体系：将 DAP-seq 与 RNA-seq 技术结合，实现了响应调控因子直接靶基因的高效筛选与验证，解决了传统 ChIP-seq 技术依赖特异性抗体、难以区分直接 / 间接调控的痛点，为其他致病菌毒力调控因子的全基因组靶标筛选提供了可复制的研究范式。
提供了鸭疫里默氏菌减毒活疫苗的理想候选株：证实 phoP 和 phoR 单基因敲除菌株体外可正常生长，体内致病性大幅降低且无组织病理损伤，具备减毒活疫苗的核心特征，同时可作为表达外源抗原的基因工程载体，为鸭传染性浆膜炎的防控提供了全新的材料与思路。
6. 可延伸的方向
PhoP 核心靶基因的功能深度验证：对筛选出的 50 个 PhoP 直接调控靶基因进行逐一的基因敲除、回补与功能验证，明确其中的关键毒力效应基因，完善 PhoPR 介导的鸭疫里默氏菌毒力调控网络。
PhoP 调控氧化应激与宿主免疫逃逸的机制解析：深入研究 PhoP 通过 Bat 操纵子调控菌株氧化应激耐受、活性氧清除、宿主巨噬细胞内存活的具体分子机制，明确该通路在鸭疫里默氏菌体内感染过程中的核心作用。
PhoPR 双组分系统的信号感应机制研究：鉴定组氨酸激酶 PhoR 所感应的具体环境信号（如磷酸盐浓度、镁离子、宿主内环境因子、氧化还原状态等），明确其 “信号感知 - 磷酸化传递 - 转录调控” 的完整信号通路。
PhoP 体内调控功能的验证与差异分析：通过 ChIP-seq 等技术探究体内感染环境中 PhoP 的 DNA 结合特性、靶基因调控谱，对比体内外调控的差异，明确磷酸化修饰、宿主环境因子对 PhoP 调控功能的影响。
减毒活疫苗的开发与系统评价：对 ΔphoP 和 ΔphoR 敲除菌株进行免疫原性、遗传稳定性、安全性、交叉保护效果的系统评价，开发鸭疫里默氏菌多价减毒活疫苗，并验证其在田间养殖中的免疫保护效力。
新型抗菌药物靶点的开发：以 PhoPR 双组分系统为靶点，利用分子对接、虚拟筛选等技术筛选其特异性抑制剂，开发针对鸭疫里默氏菌的新型抗菌药物，解决该菌日益严重的耐药性问题。
PhoPR 与其他毒力调控系统的交叉调控研究：探究 PhoPR 双组分系统与 IX 型分泌系统（T9SS）、CRISPR-Cas 系统、其他双组分系统之间的交叉调控关系，构建鸭疫里默氏菌的全局毒力调控网络。
不同血清型菌株中 PhoPR 系统的保守性分析：分析 PhoPR 系统在 21 个血清型鸭疫里默氏菌中的序列保守性、调控功能保守性，评估其作为广谱疫苗靶点或药物靶点的潜力。
7. 测量的数据、对应图表及研究意义
鸭疫里默氏菌 RA-YM 全基因组 PhoP 结合位点的 DAP-seq 富集峰分布、基因密度、ΔphoP 菌株与野生型的 RNA-seq 差异表达基因热图的全基因组概览数据，对应图 1；研究意义：直观呈现了 PhoP 结合位点在全基因组的分布特征，共鉴定到 583 个富集峰，覆盖 764 个基因的上游区域，同时展示了 ΔphoP 菌株的全基因组表达变化，为后续 PhoP 靶基因的筛选与功能分析提供了全基因组层面的可视化基础。
PhoP DAP-seq 富集峰中鉴定的保守结合基序，以及与大肠杆菌 ArcA 结合基序的同源比对数据，对应图 2A、图 2B、图 2C；研究意义：明确了 PhoP 的核心保守结合基序为 TTTAACA，且该基序与调控厌氧代谢的 ArcA 基序高度相似，首次提示 PhoP 可能参与菌株的氧代谢与氧化应激耐受调控，为解析其毒力调控机制提供了关键的功能线索与研究方向。
PhoP 对自身操纵子上游序列的结合验证、PhoP 全长蛋白与 DBD 结构域的 EMSA 实验数据，对应图 3A、图 3B；研究意义：证实了 PhoP 存在自我调控机制，可直接结合自身操纵子的上游序列；同时明确了 PhoP 的 DNA 结合功能依赖于 N 端受体结构域，单独的 C 端 DNA 结合结构域无法完成靶序列结合，揭示了其结构与功能的内在关联。
PhoP 对 8 个候选靶基因上游序列的 EMSA 结合验证数据，以及磷酸化 / 非磷酸化 PhoP 的结合亲和力（Kd 值）测定数据，对应图 4A-4E；研究意义：体外直接验证了 PhoP 对 moxR、dnaG、dedA 等 8 个靶基因上游序列的特异性结合能力；证实非磷酸化的 PhoP 在体外仍具备稳定的 DNA 结合能力，乙酰磷酸介导的磷酸化修饰未显著改变其结合亲和力，为 PhoP 的调控机制提供了生化层面的直接证据。
ΔphoP 菌株、ΔphoR 菌株与野生型相比的差异表达基因火山图、上下调基因数量统计、重叠差异表达基因韦恩图数据，对应图 5A、图 5B、图 5C、图 5D；研究意义：明确了 ΔphoP 菌株中有 183 个差异表达基因（123 个下调、60 个上调），ΔphoR 菌株中有 136 个差异表达基因（45 个下调、91 个上调）；两者存在 59 个共同差异表达基因，其中 57 个呈同向调控趋势，揭示了 PhoP 和 PhoR 调控基因谱的共性与功能关联，为两者的协同调控作用提供了转录组层面的核心证据。
DAP-seq 鉴定的 PhoP 直接靶基因与 ΔphoP、ΔphoR 菌株 RNA-seq 差异表达基因的重叠分析韦恩图，以及 PhoP 靶基因的差异表达火山图数据，对应图 6A、图 6B；研究意义：整合多组学数据筛选出 50 个受 PhoP 直接结合并转录调控的核心靶基因，明确了 PhoP 的直接调控子主要为膜定位蛋白，清晰区分了 PhoP 的直接调控与间接调控效应，为解析其致病性调控机制锁定了核心靶标。
野生型、ΔphoP、ΔphoR 菌株的体外生长曲线数据，以及雏鸭感染后 24h、48h 血液和组织（肝脏、心脏、脑、脾脏）中的细菌载量数据，对应图 7A、图 7B、图 7C；研究意义：证实 phoP 和 phoR 基因缺失仅轻微降低菌株的体外生长速率，并非完全抑制生长，排除了生长缺陷导致毒力下降的可能性；同时证实敲除菌株在雏鸭体内的定殖能力大幅下降，血液和组织中的细菌载量显著低于野生型，直接证明了两个基因对菌株体内感染、定殖能力的关键调控作用。
雏鸭感染野生型、ΔphoP、ΔphoR 菌株后 24h、48h 的心脏、肝脏、脾脏、脑组织病理切片分析数据，对应图 8A、图 8B；研究意义：直观证实野生型菌株感染会导致雏鸭心肌纤维紊乱、炎性细胞浸润、肝细胞脂肪变性、脾淋巴细胞坏死、脑组织神经元固缩等严重病理损伤，而 ΔphoP 和 ΔphoR 菌株感染无明显组织病理变化，从组织病理学层面验证了两个基因缺失后菌株致病性的显著丧失。
PhoP 直接负调控的靶基因列表，包含基因名、表达变化倍数、P 值、功能注释数据，对应表 1；研究意义：系统列出了 34 个受 PhoP 直接结合并负调控的基因，明确其功能主要为 ABC 转运蛋白、外膜 β- 桶蛋白、LPS 组装蛋白 LptD、细胞色素 c 等膜相关蛋白，为解析 PhoP 负向调控的毒力相关通路提供了完整的基因信息。
PhoP 直接正调控的靶基因列表，包含基因名、表达变化倍数、P 值、功能注释数据，对应表 2；研究意义：系统列出了 16 个受 PhoP 直接结合并正调控的基因，重点明确了耐氧相关 Bat 操纵子（batA、batC）、MoxR 家族 ATPase 等是 PhoP 的核心正调控靶标，为揭示 PhoP 调控氧化应激耐受与致病性的机制提供了关键的基因证据。
野生型、ΔphoP、ΔphoR 菌株对雏鸭的半数致死量（LD₅₀）测定数据，对应表 S4；研究意义：精准量化了 phoP 和 phoR 基因缺失对菌株毒力的影响，野生型的 LD₅₀为 3.98×10⁴ CFU/mL，ΔphoP 和 ΔphoR 菌株的 LD₅₀分别提升至 4.22×10⁹ CFU/mL 和 1.88×10⁹ CFU/mL，毒力分别下降 4.72×10⁴倍和 1.06×10⁵倍，直接证实了两个基因是鸭疫里默氏菌的关键毒力决定因子。
8. 研究结论
本研究通过 DAP-seq 技术在鸭疫里默氏菌全基因组范围内鉴定到 PhoP 的 583 个结合峰，覆盖 764 个候选靶基因的上游区域，明确了其核心保守结合基序为 TTTAACA，该基序与大肠杆菌厌氧代谢调控因子 ArcA 的结合基序高度同源。
整合 DAP-seq 与 RNA-seq 多组学数据，筛选出 50 个受 PhoP 直接结合并转录调控的核心靶基因，这些基因的编码产物主要定位于细菌细胞膜；首次发现 PhoP 可直接正调控与氧化应激耐受相关的 Bat 操纵子，揭示了其调控菌株耐氧性与宿主内感染能力的全新机制。
体外生化实验证实，鸭疫里默氏菌 PhoP 的 DNA 结合能力不依赖于体外乙酰磷酸介导的磷酸化修饰，且其 N 端受体结构域是 DNA 结合功能的必需元件，单独的 C 端 DNA 结合结构域无法完成靶序列结合，丰富了细菌双组分系统响应调控因子的结构 - 功能关系认知。
phoP 和 phoR 单基因缺失不会显著抑制菌株的体外生长，但会导致菌株对雏鸭的致病性大幅丧失，ΔphoP 和 ΔphoR 菌株的毒力较野生型分别下降 4.72×10⁴倍和 1.06×10⁵倍，两者均为鸭疫里默氏菌的关键毒力相关因子，且 PhoR 对毒力的调控作用更为显著。
phoP 和 phoR 基因缺失后，菌株在雏鸭体内的定殖能力显著下降，无法对心脏、肝脏、脾脏、脑组织造成病理损伤，证实 PhoPR 双组分系统是鸭疫里默氏菌体内感染、组织定殖和致病的核心调控系统。
ΔphoP 和 ΔphoR 单基因敲除菌株体外可正常生长，体内致病性极低，具备作为鸭疫里默氏菌减毒活疫苗候选株的潜力，同时可作为表达外源抗原的理想基因工程载体菌株；PhoPR 双组分系统也可作为抗鸭疫里默氏菌新型药物的潜在靶点。
9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义详细解读
本研究中使用芬兰 Bioscreen C MBR 全自动微生物生长曲线分析仪，测定了鸭疫里默氏菌野生型 RA-YM、ΔphoP 敲除株、ΔphoR 敲除株在 TSB 培养基中的全周期生长曲线。实验将培养至指数期（OD₆₀₀=0.6~0.8）的三株菌调整至 OD₆₀₀=1，按 1:100 的比例转接至新鲜 TSB 培养基，在 37℃恒温条件下连续培养 48h，每 30 分钟自动检测一次 OD₆₀₀吸光度值，每株菌设置 5 次生物学重复，最终获得的生长曲线数据对应图 7A，其核心研究意义分为以下 6 个层面：
排除生长缺陷对毒力表型的干扰，明确基因功能与毒力的因果关系
Bioscreen 仪器的全自动、高频次连续检测，完整捕捉了三株菌从迟滞期、指数生长期到平台期的全生长周期动态。结果显示，ΔphoP 和 ΔphoR 菌株仅表现为生长速率的轻微下降，最终平台期的生物量与野生型无本质差异，并非完全的生长缺陷型菌株。这一结果直接排除了 “基因敲除导致菌株无法正常生长，进而造成毒力下降” 的潜在干扰因素，明确了雏鸭感染实验中观察到的致病性丧失，是 phoP/phoR 基因缺失导致的毒力调控网络紊乱直接造成的，而非菌株生长能力的丧失，从根本上保证了毒力表型与基因功能之间因果关系的准确性与严谨性。
提供精准的生长动力学参数，为全实验体系提供标准化的取样依据
Bioscreen 仪器输出的连续 OD₆₀₀时序数据，可精准量化三株菌的迟滞期时长、最大比生长速率、指数生长期的时间窗口、平台期的起始时间与最大生物量等关键生长动力学参数。这些定量数据为后续所有实验提供了统一的菌体生理状态标准：例如 RNA-seq 测序、氧化应激耐受实验均选择 OD₆₀₀=0.8 的指数期菌体，动物感染实验的菌液制备也基于生长曲线明确的培养条件，保证了所有生物学重复实验中菌体生理状态的高度一致性，最大程度消除了菌体生长阶段差异带来的实验系统误差，大幅提升了全实验体系结果的可靠性与可重复性。
实现多组样品的平行同步检测，保证生长数据的高统计学效力
微生物生长实验的重复性是数据可靠性的核心基础，Bioscreen 仪器的高通量检测模式可同时对数十个样品进行同步恒温培养、标准化震荡与 OD 值自动检测，完全避免了人工取样、培养环境波动、检测时间偏差带来的人为误差。本研究中每株菌设置了 5 次生物学重复，仪器的自动化检测流程保证了组内重复数据的高度一致，生长曲线的误差带极小，证实了 phoP 和 phoR 基因缺失对生长的影响是稳定、可重复的表型，而非随机误差导致，为实验结论提供了充足的统计学支撑。
为减毒活疫苗的工业化发酵生产提供核心基础工艺参数
本研究提出 ΔphoP 和 ΔphoR 菌株可作为鸭疫里默氏菌减毒活疫苗的候选株，而疫苗工业化生产的核心前提是明确菌株的发酵生长特性。Bioscreen 仪器测定的生长曲线，明确了敲除菌株在 TSB 培养基中的生长动力学特征，包括最适接种比例、指数生长期时长、最大生物量积累时间、碳源消耗规律等关键参数，为后续该菌株的发酵罐放大培养、培养基配方优化、发酵工艺参数设定提供了核心的实验室基础数据，直接推动了研究成果从基础研究向产业化应用的转化。
与多组学数据形成互证，完善 PhoPR 系统的生物学功能认知
生长曲线呈现的轻微生长速率下降，与 DAP-seq 和 RNA-seq 发现的 “PhoP 直接调控大量 ABC 转运蛋白、氨基酸代谢、能量代谢相关基因” 的结果形成了完美的表型 - 转录组互证。这一结果证实，PhoPR 双组分系统不仅是鸭疫里默氏菌毒力调控的核心，也参与了菌株基础营养代谢、能量代谢的全局调控，打破了该系统仅参与磷酸盐稳态调控的传统认知，完善了对 PhoPR 双组分系统生物学功能的全面理解。
为减毒疫苗的可行性与安全性提供了初步表型依据
理想的减毒活疫苗需具备 “体外可正常培养扩增、体内无致病性” 的核心特征。Bioscreen 的生长曲线证实，ΔphoP 和 ΔphoR 菌株在体外营养培养基中可正常生长繁殖，具备大规模工业化生产的可行性；而雏鸭感染实验证实其在体内几乎完全丧失致病性，无组织病理损伤。该生长数据与体内毒力数据形成互补，为敲除菌株作为减毒活疫苗候选株的安全性与可行性，提供了最基础的表型支撑。